福建省HIV-1CRF01_AE流行株的表型分析、基因序列特征、膜蛋白表达及感染性克隆构建的研究

摘要

人类免疫缺陷病毒(HIV)，是逆转录病毒科慢病毒属灵长类慢病毒亚属中的一类病毒。据全国两次分子流行病学调查结果表明HIV CRF01 AE重组型株正在从南部及沿海省市向周围省市扩散，CRF01 AE重组型在全国所占比例也有所增加，在福建省HIV CRF01 AE重组型为主要的流行株。本研究首次在国内开展了HIV CRF01 AE流行株的表型分析、全长膜基因的特征和表达、全长基因的特征和感染性克隆构建的研究，为本型病毒的病原学、变异特征、疫苗、诊断方法和致病机理的研究提供了坚实的基础。 一．福建省HIV-1 CRF01 AE感染者的病毒分离及其生物学表型初步研究 1．成功分离4份HIV-1 CRF01_AE感染者的毒株，Fj200604在MT-2细胞诱导了典型的合胞体(SI)，另外3个毒株没有形成明显的合胞体(NSI)：分离株Fj200601-Fj200603利用CCR5辅助受体，Fj200604利用CXCR4辅助受体。 2．分离株的生物学表型与V3环序列变异密切相关，表明通过对V3环关键氨基酸的分析可以预测HIV-1辅助受体的使用情况。 二．福建省HIV-1 CRF01_AE亚型毒株全长gp120基因序列特征分析 1．基因系统树分析显示本研究所有的样本属于HIV-1 CRF01_AE重组型，遗传变异较大，组内基因距离为9.5±2.5％。 2．V3环顶端四肽存在四种类型：GPGQ(72.24％)，GPGR(19.04％)，GPGH(4.76％)，GQGQ(4.76％)。16份(76.19％)样本可能使用CCR5作为辅助受体，1份(4.76％)样本可能使用CCR5/CXCR4受体，4份样本(19.04％)不能做出预测。 3．C1-C5区比较保守，而V1-V5环变化较大，其中V3相对保守。 4．N糖基化位点分析发现大多数位点较为保守，少数糖基化位点发生丢失和增加。 三．HIV膜蛋白gp120基因在果蝇S2细胞中的表达 1．构建了全长gp120基因和缺失V1/V2环的表达重组载体，在果蝇S2细胞中瞬时表达成功。 2．建立了稳定表达的筛选方法，筛选了稳定分泌表达全长gp120基因和缺失V1/V2环的重组果蝇S2细胞。 四．福建省13条HIV-1 CRF01_AE亚型毒株全长基因克隆及其序列特征分析 1．完成了13株HIV-1 CRF01 AE全基因组克隆，建立了HIV-1CRF01 AE全基因组扩增平台。 2．13条全基因组克隆测序提交至NCBI(美国国家生物信息数据库)的GenBank。 3．系统进化树分析表明所有13条全长基因序列与CRF01 AE参考株聚在一起，但可分成几个亚组分散在泰国分离株中。13条全长基因序列(去除超突变序列Fj061)env，gag，pol三个结构基因区的组内基因离散率均高于泰国分离株：全长基因序列Fj061证实为超突变序列。所克隆序列未出现基因水平的重组，对蛋白酶和逆转录酶的药物依然敏感。 五．福建省CRF01 AE重组型感染性克隆的构建和生物学活性初步鉴定 1．完成3个全长克隆的连接，293T细胞转染实验表明2个全长克隆(全长克隆A和嵌合全长克隆A-B)显示较好的活性。 2．全长克隆A和嵌合全长克隆A-B具有一定程度的感染PBMCs的能力和在PBMCs内进行有效复制的能力，而嵌合全长克隆A-B在PBMCs中的复制能力比全长克隆A更强些。 3．嵌合全长克隆A-B应用CCR5作为辅助受体，而全长克隆A未观察到细胞对辅助受体的利用情况。

目录

声明

摘要

第一部分福建省HIV-1感染者的病毒分离及生物学表型初步研究

材料和方法

1实验材料

2实验方法

结果

1分离毒株的流行病学资料

2病毒分离结果

3 HIV融合诱导性实验

4辅助受体利用实验

5 V3环氨基酸序列

讨论

1 HIV-1 CRF01_AE的分离及生物学表型

2中国HIV-1临床分离株的V3环氨基酸序列分析

第二部分福建省HIV-1 CRF01_AE亚型毒株全长gp120基因序列特征分析

材料和方法

1实验材料

2实验方法

结果

1亚型分析情况

2基因系统进化树和基因距离分析

3 V3环顶端四肽分析

4辅助受体使用预测

5氨基酸变异分析

6 N糖基化分析

讨论

第三部分HIV膜蛋白gp120在果蝇S2细胞中的表达

材料与方法

1实验材料

2实验方法

结果

1全长gp120和gp120△V1/V2基因的扩增及克隆

2表达蛋白的检测

讨论

第四部分福建省13条HIV-1 CRF01_AE亚型毒株全长基因克隆及其序列特征分析

材料和方法

1实验材料

2实验方法

结果

1全长基因分析结果

2近似全长基因或半长基因的扩增结果及酶切鉴定

3全长基因重组分析

4 HIV-1近似全长基因系统进化树和基因距离的分析

5超突变全长序列Fj061的分析

6 V3环序列分析

7耐药基因变异分析

讨论

第五部分福建省CRF01_AE重组型感染性克隆的构建和生物学活性初步鉴定

材料和方法

1实验材料

2实验方法

结果

1全长克隆的构建

2全长克隆转染293T细胞

3全长克隆感染PBMCs能力和复制能力的初步研究

4构建感染性克隆的生物学初步研究

5 V3环序列特征变化

讨论

结论

参考文献

文献综述 人类免疫缺陷病毒病原学及其相关研究进展

附录

致谢