眼镜蛇毒神经生长因子的提取及抗PC12细胞凋亡的研究

摘要

目的:阿尔茨海默病(AD)是神经系统常见的以认知障碍为特征的退行性疾病，以基底前脑胆碱能神经元的退变为主要的病理特征之一。β-淀粉样蛋白(Aβ)是脑内细胞外老年斑的主要成份，其通过凋亡途径致细胞死亡在AD的神经元丢失中起重要作用。神经生长因子(NGF)为胆碱能神经元的重要营养因子，动物实验和体外细胞培养提示NGF能有效保护胆碱能神经元受损伤导致的神经变性，使NGF的潜在药物作用备受瞩目。NGF主要通过其高亲和性酪氨酸蛋白激酶受体TrkA介导其信号，与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)/蛋白激酶B(PKB，Akt)途径、Ras-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK，ERK)途径间相互联系。该文旨在通过以β-淀粉样蛋白毒性片断Aβ<,25-35>诱导大鼠嗜铬瘤细胞株PC12细胞凋亡建立体外AD细胞模型，研究从眼镜蛇毒分离的NGF是否有抗β-淀粉样蛋白致凋亡的作用并探讨可能的机制。通过应用TrkA受体信号通路激酶的特异阻断剂、检测caspase-3的活性及Bcl-2表达的变化，着重探讨NGF抗β-淀粉样蛋白致PC12细胞凋亡作用的相关信号转导通路，为阐明AD的发病机理及其预防和治疗提供实验依据。 方法: (1)应用Sephadex-G50凝胶层析、CM-Sepharose FF阳离子交换层析及Sephacryl S-200 High Resolution柱层析从中华眼镜蛇粗毒中分离纯化NGF，以PC12细胞生物活力测定为跟踪检测手段；应用SDS-PAGE和IEF-PAGE分别测定纯化NGF的分子量和等电点。 (2)应用PC12细胞建立β-淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡模型，以荧光显微镜观察细胞形态变化，DNA凝胶电泳，四唑氮蓝(MTT)法，乳酸脱氢酶(LDH)释放法，流式细胞术等检测凝聚态β-淀粉样蛋白毒性片断Aβ<,25-35>诱导的PC12凋亡，同时检测蛇毒NGF干预下细胞的凋亡变化。 (3)P13-K/Akt、Ras/细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)途径是NGF受体后细胞增殖和分化调控的基本信号传导通路。为明确P13-K/Akt、Ras/ERK是否参与NGF受体介导的抗β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的作用，Western-blot法检测NGF作用的PC12细胞胞浆的Akt、ERK1/2磷酸化活性变化，并应用PI3-K的特异抑制剂LY294002和ERK1/2的特异抑制剂PD98059分别调控其活性，流式细胞仪等观察应用抑制剂后对PC12细胞暴露Aβ<,25-35>及NGF干预的细胞凋亡的变化，同时以Western-blot法测定细胞Bcl-2表达和caspase-3活性的变化。 结论: (1)建立简单的分离方法，从眼镜蛇粗毒中分离获得电泳纯NGF，生物学活性良好，有利于正确评价天然来源NGF的作用。 (2)凝聚态Aβ<,25-35>对PC12细胞具有毒性作用，经形态学观察、DNA梯带电泳、流式细胞仪等分析，显示20μmol/L Aβ<,25-35>能有效建立PC12细胞凋亡模型。 (3)蛇毒来源的NGF有部分对抗Aβ<,25-35>致PC12细胞凋亡的作用。 (4)眼镜蛇毒来源的NGF抗Aβ<,25-35>诱导的PC12细胞凋亡的作用与PI3K/Akt途径相关，通过激活P13K—→激活Akt—→上调Bcl-2的表达—→降低caspase-3激活—→抑制细胞凋亡。 (5)本实验结果显示蛇毒来源的NGF抗Aβ<,25-35>诱导的PC12细胞凋亡的作用与ERK途径间未见明显相关，抑制ERK1/2的活性，对细胞的凋亡无明显影响。 综上所述，眼镜蛇毒来源的神经生长因子能部分对抗β-淀粉样蛋白毒性片断Aβ<,25-35>诱导的大鼠嗜铬瘤PC12细胞的凋亡，与通过激活P13-K/Akt途径并促进Bcl-2的表达和抑制caspase-3的激活相关。

目录

论文说明：英文缩写及中英文对照

声明

引言

第一部分：眼镜蛇毒神经生长因子的提取及其特性

1 材料和方法

2结果

3讨论

4小结

第二部分：NGF抗β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的作用

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

第三部分：NGF抗β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡机制的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

结论

参考文献

致谢

综述 神经细胞凋亡的信号传导途径