酵母重组表达SS-B抗原的纯化和快速检测抗SS-B抗体斑点免疫金渗滤法的建立

摘要

目的：利用毕赤酵母真核表达系统分泌表达重组蛋白SSB抗原，经过硫酸铵盐析、聚丙烯酰胺凝胶电泳后胶提取获得纯化重组SSB抗原；利用纯化SSB抗原建立检测抗-SSB抗体的斑点免疫金渗滤法。 方法： 1.SSB基因重组毕赤酵母菌株SMD1168经过甲醇诱导，分泌表达重组蛋白SSB抗原于培养基上清中。 2.利用硫酸铵沉淀和SDS-PAGE胶提取分离纯化毕赤酵母菌分泌表达的重组SSB抗原。 3.制备胶体金，标记金黄色葡萄球菌蛋白A，将纯化重组SSB抗原固定在硝酸纤维素膜上，建立斑点免疫金渗滤法(dot immunogold filtration assay，DIGFA)检测临床标本，结果与欧蒙医学实验诊断有限公司的斑点酶免疫法比较。 结果： 1.SSB基因重组毕赤酵母菌分泌表达的重组SSB抗原在培养的第5天达到了相对高峰，背景蛋白相对最低。 2.上清液中的重组SSB抗原，经过终浓度为50％(w/v)的硫酸铵沉淀，获得浓缩：浓缩蛋白液经过SDS-PAGE后，SSB抗原与杂蛋白分离；切出含SSB抗原的胶条通过电洗脱和透析，得到了具有抗原反应活性的纯化SSB抗原。 3.利用重组SSB抗原建立斑点免疫金渗滤法，检测了100份临床标本，与欧蒙斑点酶免疫法相比较，两者之间符合率为92％。利用同批试剂进行每月一次为期3个月的重复检测实验，结果显示重组SSB抗原具有良好的稳定性。 结论： 1.毕赤酵母真核表达系统分泌表达的重组SSB抗原含量高，背景杂蛋白少，组合使用硫酸铵沉淀、聚丙烯酰胺凝胶提取、电洗脱、透析等简单分离方法即可获得纯化重组SSB抗原。 2.纯化重组SSB抗原纯度高，具有较好的抗原性。建立的斑点免疫金渗滤法，用于检测抗-SSB抗体显示出很好的特异性和敏感性。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

引言

第一部分毕赤酵母菌SMD1168分泌表达重组SSB抗原的条件优化

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二部分重组SSB抗原的纯化

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第三部分建立斑点免疫金渗滤法

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

结 论

参考文献

致 谢

综 述：狼疮La蛋白的分子生物学研究进展