乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP257抗α干扰素机制初步探讨

摘要

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。HBV感染可导致肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。HBV属于嗜肝DNA病毒，具有部分双链环状的DNA基因组。HBV通过特有的逆转录反应进行复制。HBV编码的DNA聚合酶/逆转录酶(DNA polymerase/Reverse transcriptase，DNA pol/RT)的结构和功能在其复制过程中起重要作用。1976年，α-干扰素(Interferon-α，IFN-α)被成功用于治疗慢性乙型肝炎，它通过建立细胞内抗病毒状态和免疫调节作用抑制并清除病毒。但临床发现约2/3的患者对IFN-α治疗无反应，这与HBV DNA聚合酶有关。Foster等发现，HBV DNA聚合酶的末端蛋白(TP)可显著抑制细胞对IFN-α反应，并认为是由TP表达阻断IFN-α通路引起。本实验室先前通过构建一系列基因缺失突变体方式，发现HBV DNA聚合酶末端蛋白+Spacer区(部分或全部)具有抗IFN-α作用，其中末端蛋白+部分Spacer区共计257个氨基酸(TP257)抗IFN-α作用尤为明显，但其机制尚不清楚。本研究拟应用AdEasy XL Adenoviral Vector System表达TP257蛋白并通过免疫沉淀筛选与相互作用的细胞蛋白，初步探讨HBV DNA聚合酶TP区IFN-α作用机制，为研制新的抗HBV药物提供新的思路。
　　 为包装重组腺病毒AD-TP257，并在Huh7细胞中获得表达，首先构建穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-TP257，并重组到腺病毒骨架载体pADEasy-1，通过293A细胞包装重组腺病毒，感染人肝癌细胞Huh7，Western-blot验证TP257蛋白表达；为筛选与TP257抗干扰素效应相关细胞蛋白，分别在重组腺病毒感染细胞前或感染细胞后加入IFN-α，收获细胞蛋白进行免疫沉淀，通过质谱鉴定差异蛋白。实验结果表明重组腺病毒AD-TP257能有效感染Huh7细胞并大量表达TP257蛋白；重组腺病毒AD-TP257感染细胞后加入IFN-α并通过免疫沉淀筛选到三种候选差异蛋白，经质谱鉴定分别为：热休克蛋白60、组蛋白HIST1H2BC和肌凝蛋白调节轻链12A。因此，TP257可能通过上述蛋白影响病毒的抗干扰素效应。

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结论

参考文献

论文综述 乙型肝炎病毒复制机理研究进展

附录

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