膜铁转运蛋白1在缺氧缺血脑室周围白质软化大鼠动物模型和细胞模型中的表达及意义

摘要

第一部分缺氧缺血脑室周围白质软化大鼠动物模型的建立
　　 【目的】建立新生4日龄SD大鼠缺氧缺血脑室周围白质软化（PVL）动物模型，通过形态学、分子生物学及神经行为学方法对该模型进行评价。
　　 【方法】
　　 1. 新生4日龄SD大鼠通过随机数字表法随机分为两组：对照组和PVL组；对照组仅分离双侧颈总动脉不予结扎和缺氧，PVL组采用双侧颈总动脉结扎联合缺氧方法建立PVL动物模型。
　　 2. 应用HE染色法观察脑组织结构病理学改变，以免疫荧光组织化学染色法和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测HI后12周内APP和MBP表达变化，观察轴突和髓鞘损伤情况。
　　 3. 观察并记录对照组和PVL组大鼠术前至HI后7周体重变化，以感觉反射实验、悬吊实验、悬崖逃避实验和倾斜板实验测定HI后12周感觉运动功能变化，应用Morris水迷宫实验检测HI后12周大鼠认知功能水平。
　　 【结果】
　　 1. 对照组存活率为100％；PVL组存活率为89.2％，存活者约10％存在单眼或双眼未能睁开，偶可出现单眼或双眼白内障。
　　 2. HE染色可见脑室周围白质纤维排列紊乱、疏松、胶质细胞增生和脑白质软化灶形成；皮质和海马轻度损伤。
　　 3. 免疫荧光组织化学染色法和Western blot法显示，HI后PVL组APP表达较对照组增强，而MBP表达量均较对照组降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
　　 4. HI后7周内，PVL组体重增长缓慢，与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。
　　 5. 对照组平均睁眼时间为13.33±0.58天，PVL组为21±2.0天，较对照组明显延迟（P＜0.01）。
　　 6. 对照组出现耳廓反射的时间为15.33±0.58天，PVL组为20.67±1.53天，较对照组明显延迟（P＜0.01）。
　　 7. HI后4周、8周与12周，与对照组相比，PVL组双臂悬吊时间缩短、悬崖逃避能力减弱、倾斜板实验转头时间延长（P＜0.05）。
　　 8. Morris水迷宫实验从游泳曲线、平均逃避潜伏期、平均游泳速度、穿越平台次数和靶象限时间百分比进行比较，发现PVL组大鼠于HI 4周、8周与12周认知功能水平均较对照组低（P＜0.05）。
　　 【结论】
　　 1. PVL组大鼠主要表现为脑室周围纤维排列紊乱、疏松和白质软化灶形成，并出现轴突损害和髓鞘生成障碍；皮质和海马存在轻度损伤。
　　 2. PVL组大鼠出现生长发育障碍，在HI 4周、8周与12周即幼鼠期、青春期与成年期均可出现感觉运动功能减弱和空间学习记忆能力减退。
　　 3. PVL组大鼠出现的组织病理结构改变及生长发育和神经行为学功能障碍与临床PVL患者的特征相一致。
　　 4. 新生4日龄SD大鼠经双侧颈总动脉结扎联合缺氧成功建立缺氧缺血脑室周围白质软化动物模型。
　　 第二部分膜铁转运蛋白1在缺氧缺血脑室周围白质软化大鼠模型中的表达及意义
　　 【目的】
　　 1. 明确PV4周内不同脑区（皮质、海马和脑室周围白质）铁分布和铁含量的变化。
　　 2. 明确PV 4周内不同脑区（皮质、海马和脑室周围白质）FP1在mRNA和蛋白水平的表达变化。
　　 3. 探讨FP1在PVL发病中的意义。
　　 【方法】
　　 1. 新生4日龄SD大鼠随机分为对照组和PVL组，对照组仅分离双侧颈总动脉不予结扎和缺氧，PVL组采用双侧颈总动脉结扎联合缺氧方法建立PVL动物模型。
　　 2. 应用普鲁士蓝铁染色法观察PVL4周内皮质、海马和脑室周围白质铁分布情况，以石墨炉原子吸收分光光度法观察上述脑区铁含量的变化。
　　 3. 应用免疫荧光组织化学染色法、实时荧光定量PCR法及Western blot法检测FP1mRNA和蛋白在PVL4周内不同脑区的表达变化。
　　 【结果】
　　 1. PVL 1天与3天各脑区铁染色阳性颗粒较对照组相比无明显差异；PVL 1周时皮质和海马出现少量铁染色阳性颗粒，脑室周围白质铁染色明显增强，出现较多铁染色阳性颗粒。
　　 2. PVL 1周时与对照组相比，皮质铁含量升高了21.2％(P＜0.05)，海马铁含量增加11.21％(P＜0.05)，脑室周围白质铁含量升高了40.46％(P＜0.05)；PVL 4周时皮质和脑室周围白质铁含量仍较高，与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，而海马铁含量已接近对照组水平（P＞0.05)。
　　 3. 免疫荧光组织化学染色法显示，FP1表达于皮质锥体神经元胞体和树突、海马神经元胞体和突起及脑室周围白质。
　　 4. PVL 1周各脑区FP1mRNA和蛋白表达水平均较对照组明显降低；PVL 4周时皮质FP1表达量有所恢复，海马已接近对照组水平，但脑室周围白质FP1仍较低，与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 【结论】
　　 1. 缺氧缺血PVL可见脑铁代谢失衡，表现为皮质、海马和脑室周围白质铁含量升高，尤以脑室周围白质铁沉积和铁含量升高为著。
　　 2. 缺氧缺血PVL可见FP1表达下调，表现为皮质、海马和脑室周围白质FP1mRNA和蛋白表达水平降低，尤以脑室周围白质FP1下降为著。
　　 3. 新生4日龄SD大鼠缺氧缺血FP1表达下调引起脑铁含量升高，可能是其PVL发病机制之一。
　　 第三部分膜铁转运蛋白1在缺氧缺血脑室周围白质软化细胞模型中的表达及意义
　　 【目的】
　　 1. 原代培养、纯化并鉴定O2A祖细胞。
　　 2. 明确FP1在原代培养O2A祖细胞中的表达及功能。
　　 3. 建立切实可行的缺氧缺血PVL细胞模型。
　　 4. 明确FP1在PVL细胞模型中的表达变化及意义。
　　 【方法】
　　 1. 取新生4日龄SD大鼠大脑皮层，采用两次恒温摇床振荡培养法并应用条件培养基，获取O2A祖细胞；通过倒置相差显微镜结合免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞种类并判定纯度。
　　 2. 应用免疫荧光细胞化学双标技术检测FP1在O2A祖细胞中的表达并通过铁释放实验检测其功能。
　　 3. 应用糖氧剥夺(OGD)法建立PVL细胞模型，以倒置相差显微镜观察细胞形态变化、CCK-8法测定细胞存活率及LDH活性检测进行评价。
　　 4. 以实时荧光定量PCR法及Western blot法观察FP1在PVL细胞模型中的表达变化，探讨其意义。
　　 【结果】
　　 1. 倒置相差显微镜下见O2A祖细胞胞体呈圆形或椭圆形，折光性强，具有单极、双极或三极突起，突起细直无分支；O2A祖细胞可表达A2B5，经免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞纯度高达95％。
　　 2. 免疫荧光细胞化学双标技术染色结果显示，O2A祖细胞能够表达FP1并且FP1定位于细胞膜、细胞质和突起。
　　 3. 铁释放实验显示，O2A祖细胞常规培养组细胞内的荧光强度呈时间依赖性增强，OX42抗体处理组细胞荧光强度亦呈时间依赖性增加，与常规培养组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而FP1抗体处理组细胞荧光强度未见明显增加，与常规培养组和OX42抗体处理组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 4. OGD3h、6h、12h和24h，O2A祖细胞形态发生缺氧缺血性改变，至OGD24h多数细胞碎裂死亡；细胞存活率呈时间依赖性降低，至OGD24h存活率仅49.4％；细胞培养上清液中LDH活性呈时间依赖性升高，至OGD24h达高峰。
　　 5. 与对照组相比，OGD3h、6h、12h FP1mRNA和蛋白表达水平均呈时间依赖性降低，至OGD 12h表达量最低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 【结论】
　　 1. 新生4日龄SD大鼠大脑皮层经两次恒温摇床振荡培养法结合条件培养基可获取纯度高达95％的O2A祖细胞。
　　 2. O2A祖细胞能够表达FP1并且主要位于细胞膜、细胞质和突起。
　　 3. FP1可促进O2A祖细胞内铁释放，是调节铁代谢的重要蛋白。
　　 4. O2A祖细胞经OGD3h、6h和12h可建立可行的PVL细胞模型。
　　 5. FP1在PVL细胞模型中的表达呈时间依赖性降低，其表达下调可能限制细胞内的铁外排，加重细胞缺氧缺血损伤。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

前 言

第一部分 缺氧缺血脑室周围白质软化大鼠动物模型的建立

第二部分 膜铁转运蛋白1在缺氧缺血脑室周围白质软化大鼠模型中的表达及意义

第三部分 FP1在缺氧缺血脑室周围白质软化细胞模型中的表达及意义

结 论

参考文献

综述 Hepcidin与Ferroportin 1的研究进展

致 谢