下丘脑“神经网络”的增龄性改变对GnRH神经元功能的影响

摘要

目的：下丘脑在整个生殖功能的衰退中起着至关重要的作用，尤其是下丘脑GnRH(gonadotropin releasing hormone)神经元作为神经网络调节生殖的“最终输出神经元”更是在其中起到了关键性的作用。研究表明生殖下降的早期阶段，GnRH神经元的活化水平下降，但其中的机制不是很清楚。GnRH神经元自身不表达ERα(estrogen receptor alpha)，其活化水平受表达ERα并传入GnRH神经元的中间神经环路的影响。本研究旨在明确下丘脑GnRH神经元功能改变在小鼠生殖能力下降过程中的作用，并深入探讨影响GnRH神经元功能的中间神经环路包括Kisspeptinergic、Glutamatergic、GABAergic神经元及星形胶质细胞等的增龄性改变在生殖老化过程中的作用。
　　方法：⑴依据月龄、阴道涂片监测小鼠动情周期情况及血清LH水平，将雌性C57BL/6J小鼠分为年轻组(3-4月龄）、中年组(9-10月龄）和老年组(18-19月龄），同时年轻组和中年组又分为动情后期（动情间期的第一天）和动情前期(LH＞5ng/ML）组。⑵采用多聚甲醛固定、冰冻连续切片的方法制作30um厚度的脑片。参考小鼠脑立体定位图谱和文献，定位正中隔(medial septum,MS）、视前区嘴缘(rostral preoptic area，rPOA)及第三脑室嘴缘室周带(rostral periventricular of the third ventricle，RP3V）等区域。⑶借助免疫组织化学单标的方法检测GnRH、ERα、Kisspeptin、PR(progesterone receptor)的表达情况，免疫组织化学双标的方法检测 Kisspeptin神经元的活化(c-fos/Kisspeptin）、GnRH神经元的活化(c-fos/GnRH）、Kisspeptin神经元共表达ERα和PR的情况。通过体视学分析系统计数以上分子在下丘脑RP3V的表达水平。⑷通过免疫荧光三标的方法观察rPOA区谷氨酸囊泡转运体(vesicular glutamate transporter,VGLUT2)和γ-氨基丁酸囊泡转运体(vesicular GABA transporter,VGAT)的表达水平，用免疫荧光双标的方法观察该区域突触相关蛋白(synapsinⅠ）和突触素(synaptophysin,SYN）的共定位情况。⑸解剖分离RP3V，采用Real-time RT PCR检测该区域GnRH、Kiss1、Esr1及Pgr基因的mRNA水平。⑹通过western-blot检测p16、谷氨酸脱酸酶(glutamic acid decarboxylase67,GAD67）、突触素(synaptophysin,SYN）、突触相关蛋白(synapsinⅠ）及钙调蛋白激酶(Ca2+-mediated protein kinaseⅡalpha,CaMKⅡα）的磷酸化水平。⑺结合形态学、p16的表达、衰老相关β-半乳糖苷酶染色等方法，观察了下丘脑的衰老程度及衰老神经元和胶质细胞的类型。
　　结果：
　　⑴小鼠外在生殖表现和生殖轴三个水平的增龄性变化。
　　小鼠动情周期出现增龄性的异常，中年动情周期不规则的小鼠，其卵巢形态学和LH水平均正常。中年鼠与年轻鼠比较，动情前期时不仅下丘脑GnRH的mRNA水平下降，而且GnRH神经元的活化水平亦明显下降，但GnRH神经元的总数量和形态没有发生改变。
　　⑵下丘脑Kisspeptin神经元的增龄性改变对GnRH神经元活化的影响。
　　1、中年鼠c-Fos阳性的GnRH神经元与c-Fos阳性的Kisspeptin神经元呈平行下降，提示中年鼠Kisspeptin神经元活化水平的下降可以减轻GnRH神经元的活化水平。
　　2、中年鼠与年轻鼠比较，动情前期时不仅 Kisspeptin神经元的活化水平明显下降，而且免疫反应阳性Kisspeptin神经元的数量也下降，提示中年鼠Kisspeptin神经元对于雌激素的敏感性下降。
　　3、下丘脑RP3V区ERα、PR及PR阳性的Kisspeptin神经元的表达水平均没有发生增龄性的改变，但表达ERα的Kisspeptin神经元的比率出现增龄性的下降。
　　4、RP3V区Kisspeptin神经元出现增龄性的异常形态和分布特征，并且异常形态的Kisspeptin神经元均不表达ERα和c-Fos。
　　⑶下丘脑RP3V区神经细胞的衰老程度及衰老神经元和胶质细胞的类型。
　　1、衰老小鼠脑内不存在SAHF/DAPI现象，可借助形态学特征、p16的表达、SA-β-Gal和免疫组化染色相结合的方法确定衰老神经细胞的类型和程度。
　　2、下丘脑RP3V区的细胞出现增龄性的衰老，rPOA的细胞衰老不如RP3V明显。3、随增龄过程，RP3V区的Kisspeptin神经元而不是GnRH神经元出现衰老。
　　4、下丘脑RP3V区的星形胶质细胞出现衰老，相同月龄鼠下丘脑rPOA、皮层和海马均未见到衰老的星形胶质细胞。老年鼠下丘脑 RP3V区的小胶质细胞未出现衰老。
　　⑷GABAergic的增龄性改变对GnRH神经元活化的影响。
　　1、动情周期和增龄不影响rPOA区VGLUT2的表达，随着月龄的增加VGAT的表达上调，但GAD67的表达水平未见异常。
　　2、年轻鼠动情前期较动情后期，synapsinⅠ和CaMKⅡα的磷酸化水平明显上调，提示正反馈效应时rPOA区突触释放递质的能力明显增强。
　　3、随着月龄的增加rPOA区synapsinⅠ和SYN的共定位明显增加，并且synapsinⅠ和CaMKⅡα的磷酸化水平明显下降，提示中年鼠rPOA区突触前释放递质的能力较年轻鼠明显减弱。
　　结论：
　　下丘脑GnRH神经元的活化水平下降是小鼠生殖能力减退的早期关键事件。RP3V区Kisspeptin神经元出现衰老和表达ERα水平的下降导致了中年鼠动情前期时Kisspeptin神经元的活化水平下降，继而影响了GnRH神经元的活化。脑老化过程中，下丘脑RP3V部位的星形胶质细胞和Kisspeptin神经元的衰老可能是GnRH神经元功能改变的主要原因。下丘脑rPOA区γ-氨基丁酸囊泡转运体水平的增龄性上调和突触前囊泡释放神经递质能力的下降可能在生殖衰老的过程中发挥了重要的作用。

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引言

第一部分 GnRH神经元的活化水平出现增龄性下降

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分 下丘脑Kisspeptin神经元的增龄性改变影响了GnRH神经元的活化

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分 RP3V区Kisspeptin神经元和星形胶质细胞的衰老可能是GnRH神经元功能改变的主要原因

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

第四部分 GABAergic神经元的增龄性改变可能影响了

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

总结

参考文献

下丘脑Kisspeptin在生殖发育、成熟及老化过程中的作用

致谢

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