肾上腺髓质素基因转染的骨髓间充质干细胞缺氧共培养对新生大鼠心肌细胞凋亡的影响

摘要

目的:研究肾上腺髓质素（ADM）基因转染的骨髓间充质干细胞（MSCs）缺氧共培养对新生大鼠心肌细胞凋亡的影响。
　　方法:贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒(Ad-ADM)对骨髓间充质干细胞感染率。乳鼠心肌细胞分离、纯化、培养与鉴定。乳鼠心肌细胞缺氧、无血清条件下培养3、6、12、24小时并检测其凋亡率。用Transwell小室缺氧、无血清条件下共培养骨髓间充质干细胞和乳鼠心肌细胞，24小时后检测共培养体系上清液中肾上腺髓质素含量并检测乳鼠心肌细胞凋亡率。实验分组为：Ad-ADM转染共培养组，Ad-Null转染共培养组，wildtype共培养组，同时设置单独乳鼠心肌细胞缺氧、无血清培养组。
　　结果:重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数（MOI）具有量效关系，MOI为150时细胞的感染率达95.4％。在缺氧、无血清培养条件下，乳鼠心肌细胞在缺氧3h、6h、12h、24h的凋亡率逐步升高，各时间点凋亡率差异具有统计学意义（P＜0.001）。三组共培养体系中乳鼠心肌细胞凋亡率明显低于单独乳鼠心肌细胞缺氧培养组（P＜0.05）；Ad-ADM转染共培养组乳鼠心肌细胞凋亡率低于空载体转染、共培养组和未转染、共培养组（P＜0.05）。空载体转染、共培养组和未转染、共培养组相比，乳鼠心肌细胞凋亡差异未达到统计学意义。肾上腺髓质素基因转染共培养组的上清液中肾上腺髓质素分泌量高于空载体转染共培养组和未转染共培养组（P＜0.05）。空载体转染共培养组与未转染共培养组相比，肾上腺髓质素差异未达到统计学意义。
　　结论:与骨髓间充质干细胞共培养可以降低缺氧、无血清培养条件下乳鼠心肌细胞的凋亡率。与未转染的骨髓间充质干细胞相比，在缺氧、无血清培养条件下（24小时），肾上腺髓质素基因转染可以增强共培养对乳鼠心肌细胞的凋亡的影响，这可能与肾上腺髓质素表达增加有关。

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主要英文缩略词

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前言

材料

1 ．实验动物、病毒及293A细胞

2．主要试剂

3．主要设备及器械

方法

1 ． 2 93A细胞的复苏和冻存

2．腺病毒的扩增

3．病毒感染滴度的测定（采用病毒滴度噬斑测定法）

4．骨髓间充质干细胞的分离、培养及传代

5．骨髓间充质干细胞的鉴定（采用流式细胞法鉴定）

6 ． A d-ADM对骨髓间充质干细胞感染率的测定

7 . 乳鼠心肌细胞分离、纯化及原代培养[17]

8 . 心肌细胞鉴定[17]

9.心肌细胞缺氧、无血清培养

10.细胞培养缺氧条件的构建

11. 分组及骨髓间充质干细胞与乳鼠心肌细胞共培养

12. ELISA测定共培养体系上清液中肾上腺髓质素浓度

13. Tune l 法检测细胞凋亡并计算凋亡指数

14．统计分析

结果

1 ． 2 93A细胞的培养、腺病毒的扩增及滴度测定

2．大鼠骨髓间充质干细胞的形态观察和坚定

3 ． A d-ADM对骨髓间充质干细胞感染率的测定

4.乳鼠心肌细胞形态学及鉴定

5.乳鼠心肌细胞缺氧无血清培养凋亡情况

6. ELISA法检测缺氧共培养体系上清液中肾上腺髓质素浓度

7. TUNEL法检测缺氧共培养体系中乳鼠心肌细胞凋亡情况

讨论

结论

4. 参考文献

综述

参考文献

致谢