雌激素受体α在小鼠植入前胚合子型基因激活中的作用机制探讨

摘要

目的： 1、探讨雌激素受体α（estrogen receptor alpha，ERα）及其磷酸化激活形式pERα-S118在小鼠1-细胞胚和2-细胞胚中的阶段特异性表达与小鼠合子型基因激活的关系。 2、探讨ERα特异性抑制剂MPP处理对小鼠植入前胚发育的阶段特异性影响，及其对合子型基因激活的作用机制。 3、探讨ERα通过microRNA途径影响小鼠合子型基因激活的机制，并研究其对干细胞关键因子Oct4和Sox2的调控作用。 方法： 1、采用输卵管冲洗的方式，于hCG注射后15 h~54 h每隔3 h收集小鼠植入前胚，利用细胞免疫荧光技术检测ERα和pERα-S118的表达定位。 2、收集昆明小鼠1-细胞胚、2-细胞胚和4-细胞胚，以空白KSOM培养液（单纯型优化的胚胎培养基）为对照组，以KSOM中添加MPP为实验组；将各时间点收集的植入前胚培养3 h后再移入新KSOM培养液中继续培养至囊胚阶段，并记录囊胚数。于hCG注射后21 h收集小鼠1-细胞胚，置于MPP中培养，于hCG后27 h，提取总RNA，RT-qPCR检测合子型标志基因eIF1A和MuERV-L的表达变化；采用细胞免疫荧光技术检测经21~27 h MPP处理后，组蛋白甲基化（H3K4me3和H3K27me3）水平的改变。于hCG注射后21 h收集小鼠1-细胞胚，分别置于KSOM+BrdU和KSOM+MPP+BrdU培养液中培养，于hCG后27 h收集样品，采用抗BrdU抗体免疫染色实验观察DNA复制情况；于hCG注射后27 h收集小鼠1-细胞胚，经不同浓度MPP处理后，于hCG后42 h固定细胞，用免疫荧光技术观察2-细胞胚核像的变化；并且用BrdU掺入法检测DNA复制是否受到影响；采用免疫荧光技术检测S期启动相关因子c-MYC和E2F1的表达变化。 3、于hCG注射后27 h收集小鼠1-细胞胚，建立27~45 h MPP处理（20μmol/L）实验组和KSOM对照组模型；提取总RNA，经Megaplex逆转录以及预扩增后，进行 TaqMan定量 PCR芯片检测，收集数据；通过交集分析，筛选出差异表达的microRNA与已知小鼠精子microRNA表达谱的一致部分；然后通过microRNA靶基因注释、信号通路研究等手段，进一步分析ERα通过microRNA途径影响小鼠植入前胚发育的可能机制；采用细胞免疫荧光技术验证靶基因表达产物（Oct4和Sox2）的变化。 结果： 1、ERα在小鼠植入前胚中的核内定位首次出现于S期中期，于第一次有丝分裂期核内定位消失，重新出现于2-细胞胚早期（第一次有丝分裂的末期），并保持核内定位和胞质定位至2-细胞胚分裂期。pERα-S118在小鼠1-细胞胚的早期可见细胞核表面的定位，并且在1-细胞胚和2-细胞胚有丝分裂前期和前中期出现核内定位增强，中期出现胞质表达水平升高，于后期迅速降低；pERα-S118在2-细胞核内的定位首次出现于S期启动时。 2、MPP处理对小鼠植入前胚发育具有显著的抑制作用，其阶段特异性影响与小鼠ZGA发生的时间一致。经21~27 h MPP处理，小鼠合子型基因eIF1A和MuERV-L mRNA表达下调；1-细胞胚雄原核H3K27me3表达水平降低。MPP处理对小鼠的1-细胞胚和2-细胞胚的 S期进程都有显著的抑制作用。c-MYC和E2F1在小鼠2-细胞胚内的表达不受MPP处理的影响。 3、MicroRNA芯片结果显示，表达上调的microRNA数目（126个）多于表达下调的microRNA（64个）。受MPP处理影响的37个精源性microRNA显著参与“应激反应、大分子物质代谢、基因表达和转录后调控、基因表观遗传学调控、负反馈调控（大分子物质）代谢过程、抑制基因表达、抑制 mRNA翻译”等多种分子功能。精源性microRNA靶基因集在“DNA依赖性转录调控”中有显著的富集；而且其中的小规模合子型靶基因更显著地富集于多种生物学过程。以“Akt1–Foxo3–Stat3–ERα–Oct4”为主轴的调控网络参与了小鼠小规模合子型基因激活的DNA依赖转录调控。经MPP处理后，小鼠2-细胞胚OCT4表达水平升高，SOX2表达下调；经Akt抑制剂API-2处理后，pERα-S118表达上调。 结论： 1. ERα可通过影响小鼠早期植入前胚的 S期进程、精源性染色质的组蛋白甲基化修饰、精源性microRNA表达等途径，参与小鼠小规模合子型基因的DNA依赖性转录。 2. ERα在小鼠合子型基因激活中的作用机制还包括对干性维持关键基因Oct4和Sox2的调控。 3.而且，ERα在小鼠合子型基因激活中的作用受到Akt的磷酸化激活调控，而ERα又可以通过miR-125a-5p和miR-125a-3p途径，影响Akt的功能，形成反馈调控网络。

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第一部分 雌激素受体α在小鼠植入前胚中的阶段特异性表达

1 引言

2 材料

3 方法

4 实验结果

5 讨论

小结

第二部分 雌激素受体特异性抑制剂MPP处理实验

1 引言

2 材料

3 方法

4 实验结果

5 讨论

小结

第三部分 microRNA芯片检测及生物信息学分析

1 引言

2 材料

3 方法

4 实验结果

5 讨论

小结

总结

参考文献

综述：小鼠植入前胚发育的时序性

致谢