骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的体外构建研究

摘要

牙周病引起牙齿支持组织的破坏，是成人牙齿丧失的首位原因。骨质疏松症（osteoporosis，OP）可引起全身骨量减少，与牙周病存在一些相同的危险因素。OP引起的骨结构改变加速牙周病的发展。种子细胞移植效率及支架材料存在的相关问题使传统组织工程技术在临床应用上受到限制。细胞膜片技术（cell sheet technology，CST）是一种无需支架的细胞移植方法，可无创性获取细胞，保留完整的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、细胞表面粘附分子以及细胞间及细胞与胞外基质间的相互作用。
　　目的：
　　体外构建骨质疏松大鼠骨髓基质细胞（osteoporotic rat bone marrow stromal cells， O-rBMSCs）膜片，研究其生物学特性。
　　方法：
　　1.双侧卵巢切除术建立SD大鼠骨质疏松模型，术后12 w比较两组大鼠体型体重、血清雌二醇浓度和股骨组织学形态鉴定模型是否建立成功。2.全骨髓贴壁法体外分离培养O-rBMSCs，结晶紫染色检测细胞克隆形成能力；碱性磷酸酶染色及茜素红染色检测细胞成骨诱导后成骨分化能力；油红 O染色检测细胞成脂诱导后成脂分化能力。3.维生素C连续诱导构建O-rBMSC膜片，通过大体观察、组织学染色及电镜观察其结构。4.通过Western Blot比较O-rBMSCs及O-rBMSC膜片纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的表达，分析酶消化对细胞外基质的影响。5.连续诱导5 d、10 d形成的膜片通过Real-time PCR及免疫组织化学检测Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，Col-Ⅰ）、FN、骨膜蛋白（periostin，PN）基因及蛋白的表达，探讨O-rBMSC膜片的生物学活性。
　　结果：
　　1.成功建立 SD大鼠骨质疏松模型，其体型及体重明显增加，血清雌二醇浓度降低，股骨组织出现骨质疏松现象。2.成功分离培养了O-rBMSCs，O-rBMSCs单细胞形成的克隆经结晶紫染色观察呈集落状生长。3. O-rBMSCs成骨诱导7 d，ALP染色明显，成骨诱导21 d，茜素红染色可见红染的矿化结节；成脂诱导21 d，油红O染色可见空泡样脂滴被染成深红色。4.成功构建出完整的O-rBMSC膜片，肉眼观察呈乳白色半透明薄膜样结构，HE染色可见膜片由多层细胞及ECM组成， Masson染色可见蓝色的胶原纤维。5.扫描电镜观察到大量的ECM存在于细胞之间，透射电镜可观察到细胞、ECM、细胞间连接以及细胞器等结构。6. O-rBMSC膜片FN蛋白的表达较酶消化后的O-rBMSCs高（P<0.05）；7.与诱导5 d形成的膜片相比，诱导10 d形成的膜片Col-Ⅰ、FN、PN细胞外基质相关基因及蛋白表达上调（P<0.05）。
　　结论：
　　1.体外分离培养的O-rBMSCs具有克隆形成能力，在特定条件下可分化为成骨细胞及脂肪细胞。2.采用维生素C连续诱导培养的方法可成功构建O-rBMSC膜片，所构建的细胞膜片是由细胞及丰富的ECM组成，膜片内细胞保持良好的活力，自身分泌的ECM可作为天然的支架材料，有望应用于骨质疏松机体的组织再生。

目录

声明

英文缩略词表

第一部分 骨质疏松大鼠骨髓基质细胞的体外分离培养

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的构建

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片胞外基质研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

综述：细胞膜片技术及其在牙周组织再生中的研究进展

致谢