先天性白内障家系的致病基因突变筛查及研究

摘要

目的：
　　先天性白内障是造成婴幼儿可逆性失明的主要原因。据估计，每10000个活产婴儿的患病率为1-6例，且其中超过一半以上具有遗传性。本研究主要针对两个来自不同地区的遗传性先天性白内障家系进行致病基因的突变筛查，同时对突变位点从分子生物信息学角度进行探讨和分析。
　　对象和方法：
　　本研究在两个来自不同地区的1个三代遗传和1个四代遗传的家系中进行。
　　1.对以上现存家系成员进行详细的病史调查和眼科检查，并且绘制家系图。
　　2.经获得同意后抽取家系成员的静脉血3ml。
　　3.使用 Wizard Genomic DNA Purification试剂盒提取和纯化分别来自两个家系9位家系成员的外周静脉血基因组DNA.
　　4.以对应家系的先证者基因组为模板，运用 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应）技术扩增先天性白内障候选致病基因的突变热点区域， PCR产物纯化后进行直接DNA测序筛查突变位点。
　　5.运用Chromas2.22和CodonCode Aligner软件分析基因序列以确定相应家系的致病基因。
　　6.运用Kyte-Doolittle Hydropathy Plots，Mutation Taster，PolyPhen-2以及PROVEAN PROTEIN等生物信息学软件预测分析突变位点。
　　7.通过 SWISS-MODEL服务器建立蛋白质三维结构同源模型并且对相应的构型进行分析，以从分子生物信息学角度预测和探讨家系1和家系2的发病机制。
　　结果：
　　1.PCR产物测序结果未发现家系1与该18个白内障候选致病基因的突变热点区域存在编码区和剪切位点的致病性突变。即该家系的致病基因与本研究中的候选致病基因无关。
　　2.在家系2中PCR产物测序结果发现GJA3基因突变c.184G>A，即p.E62K,该突变导致这段碱基所编码的氨基酸由高度保守的谷氨酸变成了赖氨酸。此突变在1000genomes project和ExAC数据库中未发现，HGMD（The Human Gene Mutation Database）专业版数据库中未找到，是未报道过的新突变。
　　3.对家系2中的GJA3-E62K突变进行了生物信息学软件预测分析，软件预测结果均显示为致病性突变。
　　结论：
　　1.本研究中的两个家系均呈现为常染色体显性遗传。
　　2.家系1的DNA直接测序结果为阴性，初步判定该家系的致病基因与以下我们所筛选的候选致病基因（GJA8、GJA3、CRYGD、CRYAA、CRYBB2、CRYBA1、CRYAB、CRYGC、BSFP2、EPHA2、MAF、PITX3、HSF4、MIP、CRYGS、CRYBB1、CRYBB3、CRYBA4）无关，可能存在别的致病基因。
　　3.家系2中发现的GJA3-E62K突变为尚未报道的新突变，该突变使GJA3基因所编码的第2号外显子上的第184位碱基由鸟嘌呤G变成了腺嘌呤A
　　（c.184G>A）,致使这段碱基所编码的氨基酸由高度保守的谷氨酸变成了赖氨酸。GJA3基因突变会使相应连接蛋白（Cx）的结构和功能发生异常，进而致使先天性白内障的发生。

目录

声明

前言

材料

1. 主要的试剂及来源

2. 试剂的配制

3. 主要的仪器和实验耗材

实验方法

2.基因组DNA的提取

3. 引物的合成与配制

5.PCR产物的纯化

6.DNA测序

7.测序结果分析

结果

1.先天性白内障家系调查分析结果

2. 两家系测序结果分析

3.生物学信息软件预测分析

讨论

结论

参考文献

综述:先天性白内障的遗传和分子基础研究进展

致谢