Notch1对舌癌细胞功能的影响及建立舌癌淋巴道高转移细胞系的初步实验

摘要

舌鳞癌是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤之一。它好发于舌前2/3舌体部，以鳞状细胞癌多见，其恶性程度高、浸润性强、早期易发生淋巴结转移。本课题组早期研究表明Notch1基因促进涎腺腺样囊性癌细胞增殖、侵袭及迁移；并通过免疫组化验证Notch1在人舌癌组织中高表达。然而Notch1基因在舌鳞癌中的相关功能及分子机制的研究较少。本课题旨在验证Notch1与舌鳞癌增殖、侵袭、迁移及凋亡的关系，并探讨其可能的机制；并在建立舌鳞癌正位模型的基础上，构建舌鳞癌淋巴道高转移细胞系，研究其相关的生物学行为变化。研究内容分为以下2个部分：
　　一、Notch1基因对舌癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响
　　目的：通过抑制及过表达Notch1基因研究其对舌鳞癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响，并在裸鼠体内验证Notch1对舌鳞癌细胞CAL-27增殖能力的影响。
　　方法：
　　1.将Notch1的siRNA转染CAL-27细胞，通过Real-time PCR技术、Western Blot实验研究Notch1在RNA水平及蛋白表达水平的改变；应用CCK8法及克隆形成实验探讨Notch1表达下调后舌鳞癌细胞CAL-27增殖的变化；采用划痕愈合实验和侵袭小室实验研究抑制Notch1表达对舌鳞癌细胞CAL-27侵袭及迁移的影响；用流式细胞术检测Notch1表达下调后细胞凋亡的变化；运用实时荧光定量PCR技术探讨Notch1表达下调对其下游基因的影响。
　　2.构建pcDNA3.1-NICD1质粒，转染CAL-27细胞，过表达Notch1基因胞内段，利用Real-time PCR技术、Western Blot实验研究Notch1在RNA水平及蛋白表达水平的变化；通过CCK8法、克隆形成实验探讨过表达Notch1对舌鳞癌细胞增殖的影响；运用划痕愈合实验和侵袭小室法研究过表达Notch1对舌鳞癌细胞侵袭及迁移的影响；用Real-time PCR技术检测过表达Notch1对 Notch信号通路下游基因的影响。
　　3.将siRNA处理过的舌鳞癌细胞注入裸鼠皮下，建立皮下成瘤模型，在体内研究抑制Notch1基因对舌鳞癌细胞CAL-27相关生物学行为的影响。
　　结果：
　　1.将Notch1的siRNA转染CAL-27细胞，Real-time PCR技术、Western Blot实验结果显示Notch1在RNA水平及蛋白水平上的表达下调；CCK8实验、平板克隆形成实验证明，与阴性对照组比较，经Notch1的siRNA处理过的CAL-27细胞的增殖明显下调；划痕愈合实验和侵袭小室实验证实，抑制Notch1表达后，CAL-27细胞的侵袭及迁移也下调；同时流式细胞术实验结果也表明，当Notch1表达下调后，CAL-27细胞的凋亡率升高。在CAL27细胞内，抑制Notch1基因表达，其下游基因表达也随之下调。
　　2. pcDNA3.1-NICD1质粒过表达CAL-27细胞Notch1基因胞内段后，Real-time PCR技术、Western Blot实验结果显示Notch1表达升高；CCK8实验、克隆形成实验表明，过表达 Notch1胞内段后，CAL-27细胞增殖升高；划痕愈合实验及侵袭小室实验证实，Notch1过表达后，CAL-27细胞的侵袭及迁移也上调。过表达Notch1后，Notch信号通路下游基因的表达也随之上调。
　　3.裸鼠皮下成瘤实验证实，Notch1表达被抑制后，实验组瘤体的生长速度及质量明显小于对照组。
　　结论：Notch1基因能够促进舌癌发生发展，Notch1表达下调能够抑制舌癌的增殖、侵袭及迁移，促进舌癌细胞凋亡，而过表达Notch1胞内段能够促进舌癌的增殖、迁移以及侵袭。
　　二、舌癌淋巴道转移模型体内筛选及细胞系建立的初步实验
　　目的：在舌鳞癌正位淋巴道转移模型的基础上，建立舌癌淋巴道高转移细胞系，并对其相应的生物学行为变化进行实验研究。
　　方法：
　　1.将舌鳞癌细胞接种于裸鼠左舌前部建立舌鳞癌正位模型，40天左右，收集淋巴回流区域的肿大淋巴结进行细胞培养，从中分离并纯化淋巴转移细胞，再将得到的转移癌细胞进行多次连续体内筛选。
　　2.将舌鳞癌正位模型裸鼠的淋巴结进行HE染色，并统计淋巴结转移率。
　　3.通过CCK8法研究舌鳞癌淋巴道高转移细胞LN-3与舌鳞癌细胞CAL-27的增殖能力的变化。
　　4.运用Real-time PCR和western blot实验研究Notch1在高转移细胞LN-3与舌癌细胞CAL-27中的表达变化。
　　结果：
　　1.成功建立正位舌癌淋巴道转移模型，淋巴结转移率从5%上升至52.38%。
　　2.初步建立舌癌淋巴道高转移细胞系，高转移细胞的形态发生改变，细胞的增殖能力提高。
　　3.与CAL-27细胞相比，Notch1在高转移细胞LN-3中的表达明显升高。
　　结论：初步建立舌鳞癌正位模型及淋巴道高转移细胞系，舌鳞癌淋巴道高转移细胞的增殖上调，同时，Notch1在高转移细胞中的表达亦上调。

目录

英文缩略词表及说明

前言

第一部分Notch1基因对舌癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响

材料与方法

1.材料

2. 方法

结果

1 抑制Notch1基因表达对舌癌细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

2 过表达Notch1基因胞内段对舌癌细胞的增殖、侵袭以及迁移的影响

3 裸鼠体内验证Notch1对细胞增殖能力的影响

讨论

第二部分舌癌淋巴道高转移模型的筛选及细胞系建立的初步实验

材料和方法

1.材料

2.方法

结果

1 裸鼠舌癌正位模型的建立

2 淋巴结转移率变化

3 舌癌淋巴结高转移细胞系的建立

4 STR细胞分型鉴定结果

5 CCK8法测定细胞增殖曲线

6 Real-time PCR实验结果

7 Western Blot实验

讨论

结论

参考文献

综述：Notch1信号通路在肿瘤中的相关研究进展

致谢