3-甲基腺嘌呤及饥饿对POAG患者小梁网细胞自噬水平及MMP-2表达影响的研究

摘要

目的：
　　研究3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）及饥饿对青光眼患者小梁网细胞（Glaucomatous Trabecular Meshwork Cell，GTMC）自噬水平及基质金属蛋白酶-2（Matrix Metallopeptidase2，MMP-2）表达的影响。
　　方法：
　　1.GTMC的体外培养和鉴定：
　　1）组织块培养法体外培养GTMC；
　　2）用显微镜下观察法、细胞免疫化学染色法鉴定；
　　2.检测不同干预因素对GTMC生长的抑制作用：
　　1）将GTMC分为对照组、不同浓度3-MA（2.5、5、10、20mmol/L）分别干预24h、48h组及饥饿不同时间（6h、12h、18h、24h、36h）组；
　　2）对照组不施加任何干预，3-MA干预组细胞完全培养液中添加药物3-MA，饥饿组则以EBSS平衡液溶液(Earle? s Balanced Salt Solution,EBSS)替代细胞完全培养液进行细胞培养；
　　3）MTT法分别检测3-MA、饥饿对GTMC生长的抑制作用；
　　3.MDC荧光染色法分别检测3-MA、饥饿对GTMC自噬水平的影响；
　　4.检测各组GTMC内LC3-II、Beclin1及MMP-2表达的差异：
　　1）将GTMC分为对照组、不同浓度3-MA（1.25、2.5、5、10mmol/L）作用24h组及饥饿不同时间组（3h、6h、9h、12h），干预到点后分别提取各组 GTMC蛋白及mRNA进行检测；
　　2）RT-PCR法检测GTMC内LC3-II、Beclin1及MMP-2 mRNA的表达水平；
　　3）Western Blot法检测GTMC内LC3-II、Beclin1及MMP-2蛋白的表达水平。
　　结果：
　　1. GTMC鉴定：LN、FN、NSE及波形蛋白染色阳性，第V???因子及阴性对照组染色阴性，通过组织块体外培养法成功培养出GTMC；
　　2. MTT法检测不同干预对GTMC生长的影响：
　　1）不同浓度3-MA培养细胞24h和48h后，GTMC增殖均受抑制，其中不同浓度3-MA作用48h组对细胞增殖抑制作用较24h组更为明显；
　　2）3-MA作用24h：与对照组（0%）比较，随着药物3-MA浓度升高，细胞增殖抑制率逐渐增加，浓度2.5、5、10、20mmol/L对GTMC增殖抑制率分别为（23.55±0.94）%、（29.38±0.22）%、（31.17±0.45）%、（49.69±2.90）%，3-MA浓度大于10mM时，细胞增殖受抑制作用明显；
　　3）与对照组（0%）比较，随着饥饿时间延长，GTMC增殖抑制率逐渐增加。饥饿时间6h、12h、18h、24h、36h对 GTMC增殖抑制率分别为（27.31±1.85）%、（29.73±1.05）%、（35.06±2.06）%、（41.05±2.74）%、（46.30±3.50）%，饥饿时间长于12h时，细胞增殖明显受抑制；
　　3. MDC荧光染色显示：与对照组相比，饥饿处理组 GTMC荧光染色增强，自噬泡数目增多，提示自噬水平升高，反之，3-MA干预组细胞荧光染色减弱，自噬泡数目减少，提示自噬水平降低；
　　4.各组GTMC内LC3-II、Beclin1及MMP-2表达的差异：
　　1）3-MA组：与对照组相比，随药物浓度增加，LC3-II、Beclin1表达量逐渐下降，MMP-2表达量逐渐上升。LC3-II mRNA及蛋白表达量于浓度5mmol/L时作用最显著（P1=0.000，P2=0.046，P<0.05）；Beclin1 mRNA及蛋白表达量于浓度5mmol/L时作用最显著（P1=0.000，P2=0.009，P<0.05）；MMP-2 mRNA及蛋白表达量于浓度5mmol/L时作用最显著（P1=0.037，P2=0.034，P<0.05）；
　　2）饥饿组：对比对照组，随饥饿时间延长，饥饿组 LC3-II、Beclin1 mRNA及蛋白表达量逐渐增加，MMP-2 mRNA及蛋白表达量逐渐下降。LC3-II mRNA及蛋白表达量分别于饥饿6h、饥饿9h时作用最显著（P1=0.045，P2=0.042，P<0.05）；Beclin1 mRNA及蛋白表达量于饥饿6h时作用最显著（P1=0.021，P2=0.018，P<0.05）；MMP-2 mRNA及蛋白表达量分别于饥饿9h、饥饿6h时作用最显著（P1=0.009， P2=0.001，P<0.05）。
　　结论：
　　3-MA作用下抑制GTMC自噬激活，MMP-2表达增加；饥饿条件下促进GTMC自噬，MMP-2表达下降；提示自噬作用可能通过调节MMP-2的表达水平，间接影响小梁网ECM沉着及房水外流的阻力，从而参与POAG的发病机制。

目录

声明

中英文缩写词汇表

前言

1 实验材料

1.1 实验细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要抗体

1.4 主要实验仪器

1.5 主要耗材

1.6 主要试剂配制

2 实验方法

2.1 GTMC的体外培养与鉴定

2.2 细胞冻存、复苏

2.3 MTT法检测3-MA及饥饿对GTMC生长的抑制作用

2.4 3-MA及饥饿分别对GTMC自噬相关基因LC3-II、Beclin1及MMP-2表达的影响

2.5 主要应用的统计软件

3 实验结果

3.1 体外培养与鉴定结果

3.2 3-MA及饥饿对GTMC生长的影响

3.3 MDC荧光染色法检测3-MA及饥饿对GTMC自噬的影响

3.4 3-MA及饥饿对GTMC自噬相关基因LC3-II及Beclin1 mRNA、蛋白水平表达的影响

3.5 3-MA及饥饿对GTMC表达MMP-2 mRNA及蛋白的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

综述:自噬与原发性开角型青光眼小梁网细胞相关性研究进展

致谢