吡非尼酮干预放疗肠管纤维化的作用及机制研究

摘要

本文从以下三部分进行了阐述：
　　第一部分 吡非尼酮干预大鼠放射性肠管纤维化的实验研究
　　目的:观察吡非尼酮对大鼠放射性直肠纤维化的作用，并探讨其作用机制。
　　方法：40只SD大鼠随机分为4组：空白对照组（Control组）、单纯放疗组（Radiation组）、放疗+吡非尼酮低剂量组（200mg/kg/d,PFD200组）及放疗+吡非尼酮高剂量组（400mg/kg/d,PFD400组）。采用单次20Gy照射盆腔构建大鼠放射性直肠纤维化模型，从放疗第二天每天吡非尼酮灌胃1次。放疗12周后处死大鼠，评估放疗后损伤情况，显微镜测量粘膜下层厚度，纤维化评估采用HE及VG染色病理检查及进行纤维化评分。Real time PCR及Western Blot检测大鼠直肠组织的collagen I及α-SMA的mRNA及蛋白的表达水平，Western Blot检测大鼠直肠组织的TGF-β1、CTGF、pSmad2、pSmad3、Smad2及Smad3的蛋白表达情况。
　　结果：Radiation组大鼠放疗后出现体重下降，放射野肠管出现纤维化、狭窄，并出现不同程度的肠梗阻症状，显微镜下发现直肠粘膜下层增厚较为明显，并有大量胶原纤维蛋白聚集。PFD200组及PFD400组体重下降程度相当，但恢复较快，放射野肠管纤维化及肠梗阻症状明显缓解，未出现因放射区域肠管狭窄导致上方肠管扩张、梗阻的现象。HE及VG染色也提示粘膜下层增厚及胶原蛋白沉积明显改善。Real time PCR和Western Blot结果显示：Radiation组后大鼠直肠组织的collagen I及α-SMA的mRNA明显升高，其蛋白水平也相应升高。吡非尼酮作用能够降低放疗后升高collagen I及α-SMA的表达水平，与其作用剂量相关。Western Blot结果显示：放疗后大鼠直肠组织的TGF-β1、pSmad2、pSmad3和CTGF的蛋白表达水平明显升高，而吡非尼酮作用能抑制上述蛋白的表达水平，与作用剂量相关。
　　结论：吡非尼酮能减轻大鼠放射性直肠纤维化程度，机制与抑制TGF-β1/Smad/CTGF通路的Smad2和Smad3磷酸化有关。
　　第二部分 吡非尼酮对大鼠肠成纤维细胞的作用及机制研究
　　目的:探讨吡非尼酮对大鼠肠成纤维细胞（RIFs）的作用及机制。
　　方法：体外进行原代分离及培养RIFs，并采用流式细胞仪进行鉴定波形蛋白和角蛋白的表达。用TGF-β1诱导活化RIFs模仿体内“纤维化”环境。LDH细胞毒性实验检测吡非尼酮对RIFs的细胞毒性作用。CCK-8法检测吡非尼酮对TGF-β1诱导RIFs细胞增殖。Real time PCR及Western Blot检测吡非尼酮对TGF-β1诱导RIFs细胞分化（α-SMA）及胶原合成（collagen I）。Western Blot法检测TGF-β1/Smad通路相关蛋白，探讨可能的作用机制。采用磷酸酶抑制剂l-p-bromotetramisole验证吡非尼酮对Smad2、Smad3的磷酸化抑制作用对肠纤维化的影响，检测l-p-bromotetramisole作用于吡非尼酮后的细胞分化、胶原合成以及TGF-β1/Smad通路蛋白的影响。
　　结果：据取材部位、细胞形态学以及波形蛋白和角蛋白的流式细胞术鉴定结果，表明所培养细胞为RIFs。LDH细胞毒性实验显示吡非尼酮处理48h后无明显的细胞毒性作用。CCK-8结果显示，吡非尼酮（0.5、1.0mg/ml）对RIFs细胞增殖有抑制作用。TGF-β1（5ng/ml）作用后，RIFs增殖作用增强，但吡非尼酮（0.5、1.0mg/ml）能抑制TGF-β1增强细胞增殖作用。Real time PCR及Western Blot结果显示，TGF-β1能诱导升高RIFs的α-SMA mRNA和蛋白表达水平。吡非尼酮作用能下调TGF-β1诱导升高α-SMA的mRNA和蛋白表达水平。吡非尼酮作用能明显抑制TGF-β1诱导升高的Smad2和Smad3的蛋白磷酸化水平。l-p-bromotetramisole作用后，TGF-β1诱导RIFs升高的α-SMA和collagen I的mRNA和蛋白水平降低。抑制磷酸酶活性能明显抑制TGF-β1诱导升高的Smad2和Smad3的蛋白磷酸化水平。同时，抑制磷酸酶活性能抑制TGF-β1诱导升高的下游分子CTGF的蛋白表达。
　　结论：吡非尼酮能抑制TGF-β1诱导增强RIFs的纤维化相关活动，包括细胞增殖、肌成纤维细胞分化和胶原蛋白的合成，作用机制与抑制TGF-β1/Smad/CTGF信号通路的Smad2和Smad3磷酸化有关。
　　第三部分 吡非尼酮对人肠成纤维细胞的作用及机制研究
　　目的:探讨吡非尼酮对人肠成纤维细胞（HIFs）的作用及机制。
　　方法：用TGF-β1体外诱导HIFs“纤维化”。LDH细胞毒性实验检测吡非尼酮对人肠成纤维细胞的细胞毒性作用。CCK-8及克隆形成实验检测吡非尼酮对TGF-β1诱导HIFs细胞增殖。流式细胞术及TUNEL检测吡非尼酮对TGF-β1诱导HIFs细胞凋亡，并检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bad的表达。Real time PCR及Western Blot检测吡非尼酮对TGF-β1诱导细胞分化（α-SMA）及胶原合成（collagen I、fibronectin）等纤维化相关活动的影响，Western Blot法检测TGF-β1/Smad和PI3K/Akt通路相关蛋白。
　　结果：LDH细胞毒性实验显示吡非尼酮作用48h后无明显细胞毒性作用。CCK-8法和克隆形成实验显示，吡非尼酮抑制的HIFs的增殖活性增强及克隆形成数目。此外，吡非尼酮抑制TGF-β1诱导减弱的HIFs细胞凋亡，并增加TUNEL阳性细胞数目，同时伴有Bad蛋白表达增加，Bcl-2蛋白水平降低。Real time PCR及Western Blot结果显示，TGF-β1能诱导HIFs的α-SMA、collagen I及fibronectin的mRNA和蛋白表达增加。吡非尼酮作用能下调TGF-β1诱导升高的α-SMA、collagen I及fibronectin的mRNA和蛋白表达水平。吡非尼酮作用能抑制TGF-β1诱导升高的Smad2和Smad3的蛋白磷酸化水平。同时，吡非尼酮能抑制TGF-β1诱导升高的PI3K蛋白水平及AKT蛋白的磷酸化水平。
　　结论：吡非尼酮能抑制TGF-β1诱导增强的HIFs细胞增殖，抑制TGF-β1诱导减弱的HIFs细胞凋亡。吡非尼酮能抑制TGF-β1诱导HIFs增强的纤维化相关活动，包括肌成纤维细胞分化和胶原蛋白的合成，作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad和PI3K/Akt信号通路的磷酸化有关。

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