紫球藻的廉价培养及藻红蛋白纯化的研究

摘要

紫球藻(Porphyridium cruentum)属于红藻门的一种单细胞藻,能合成大量的藻红蛋白和胞外多糖等有效活性物质,具有广阔的应用前景。海藻的培养成本以及藻红蛋白等大分子纯化费用己成为藻红蛋白(B-PE)在医药和工业领域大量需求的重要制约因素。本论文从紫球藻(Porphyridium cruentum)的廉价培养,不同细胞破碎方法筛选,藻红蛋白规模纯化进行较系统的研究。主要实验结果如下:
　　 以细胞干重、藻红蛋白为目标产物,对复合肥培养基进行筛选优化。摇瓶培养所获得的复合肥培养基配方Ⅱ、Ⅲ培养紫球藻,获得细胞干重(1.077±0.175 g/L、0.920±0.017g/L)均高于KOCH培养基培养所获得的细胞干重(0.823±0.160g/L)。平板式光生物反应器验证培养发现,复合肥Ⅱ培养基细胞干重均大于KOCH培养体系相应的干重,差异显著(P<0.05)。复合肥Ⅱ培养藻红蛋白的含量高于KOCH培养对应的含量,差异极显著(P<0.01)。
　　 以复合肥Ⅱ培养基进行平板式光生物反应器规模培养,与补充新鲜培养液相比,利用NaHCO3和尿素进行补料培养紫球藻所合成的代谢产物含量有所增加。且当采用NaHCO3进行补料培养时,紫球藻的细胞干重为最高(1.37±0.12g/L),同样获得最高的藻红蛋白含量,与对照组相比具有极显著差异(P<0.01)。
　　 培养液回收利用实验发现,当回收培养液更新率为25％时,所构成的培养液对紫球藻生长有促进作用,培养液中藻红蛋白含量均高于其他培养体系,50％、75％等更新率的培养体系中藻红蛋白含量均比对照组低,且25％更新率所获得的藻红蛋白及多糖含量均显著差异于对照组(P<0.05)。
　　 采用溶胀法、反复冻融法、低浓度氯化钙溶液提取法和玻璃珠处理法等方法分别对紫球藻、蔷薇藻和念珠藻细胞破碎,通过测定藻红蛋白的纯度和浓度对四种细胞破碎方法效果进行比较。当细胞密度为1.000 g/L时,采用反复冻融法处理紫球藻和蔷薇藻时能够获得最高的藻红蛋白纯度(OD545/OD280),分别为1.250和1.669,藻红蛋白的浓度分别为29.788 mg/L和36.026 mg/L,细胞密度对藻红蛋白纯度影响较小；低浓度氯化钙溶液提取法能使念珠藻藻红蛋白的纯度(OD545/OD280)达到0.477。表明紫球藻和蔷薇藻经反复冻融法破碎细胞,藻红蛋白纯度高,提取效果好；而对念珠藻藻红蛋白提纯采用低浓度氯化钙溶液提取法效果好。
　　 对紫球藻藻红蛋白膜分离工艺进行优化,采用的超滤柱膜截留分子量为60～80.kDa,当压力为0.06 MPa、处理温度45℃、pH10时进行紫球藻藻红蛋白的膜分离提纯效果最佳,回收的藻红蛋白提取液进行4℃条件下硫酸铵沉淀实验,先经过15％(NH4)2SO4过夜沉淀,再经过60％(NH4)2SO4处理7 d,最终获得的藻红蛋白总收率为52.09％,纯度可达到4.29。