森林红壤微生物的功能生态学分析及宏基因组文库构建

摘要

经济适用的木质纤维素水解工艺是实现纤维素乙醇商品化的关键环节。研究土壤中多样性的木质纤维素分解微生物及其酶基因资源，将为开发新型木质纤维素水解酶系奠定基础。本文通过对一系列不同环境不同来源的森林土壤的理化及生物酶活性分析，筛选出一组具有着良好木质纤维素分解能力的酸性森林土壤样品SD。提取样品SD总基因组DNA为模板，用特异的16S rDNA及18S rDNA引物进行PCR扩增，构建环境微生物的16S rDNA及18S rDNA基因文库，并对文库进行RFLP分析(restriction fragment length polymorphism)、测序、序列分析和构建系统进化树。对该土壤细菌和真菌的菌群结构及生态功能进行分析。结果表明，从挑取的112个克隆中一共鉴定出66个不同细菌类群，主要类群包括Acidobacteria(包含Gp1、Gp2、Gp3、Gp10以及Gp13等5个簇)，Proteobacteria(包含alpha，beta，delta和gamma四亚门)，Verrucomicrobia和Unclassified Bacteria。其中，Acidobacteria是最大的类群，含有80个克隆，占总克隆数的71.5％：Proteobacteria次之，含有27个克隆，占总克隆数的24.1％。相对细菌来说，真菌菌群具有更为丰富的多样性则，鉴定出的40个不同的真菌带型包括6大类，即Ascomycota(36.2％)，Basidiomycota(42.8％)，Zygomycota(13.8％)，Chytridiomycota(2.9％)和Fungi incertae sedis(4.3％)。其中Basidiomycota和Ascomycota是18S rDNA文库克隆中的主要菌型，占总菌群的79％。分析表明SD土壤样品中包含有丰富的木质纤维素分解微生物，细菌有Syhingomonas和Burkholderia以及一些固氮细菌；真菌中包含有更多的参与木质纤维素分解的微生物种类，主要包括担子菌门的Tricholomataceae，Strophariaceae和Agaricaceae；子囊菌门的Orbilia，Aspergillus，Phialocephala，Epicoccum，Phoma和Zygomycota的Mucorales等。 为了开发这些土壤微生物所蕴含的丰富的木质纤维素分解酶基因资源，我们构建了森林土壤的宏基因组文库。通过对土壤样品总基因组DNA大量抽提、剪切、浓缩，首先获得适合文库构建的DNA。纯化的基因组片段插入Cosmid粘粒，包装，转染大肠杆菌宿主，构建成功森林土壤宏基因组文库。文库包含约230000个克隆，随机酶切和测序分析显示，插入片段平均大小为35kb，总库容为8.03 Gb。 根据NCBI数据库公布的木聚糖酶基因和漆酶基因的保守序列分别设计特异性引物，扩增获得包含有漆酶基因保守区域长121bp的DNA片段，利用该片段对宏基因组文库进行原位杂交筛选。同时通过高通量功能筛选方法对文库进行了木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶以及蛋白酶等工业用酶的初步筛选，得到了35个具有明显蛋白酶水解圈的阳性克隆，进一步的分析正在进行中。我们的研究为以后对文库的进一步筛选以及将来从土壤中鉴定更多的木质纤维素水解酶奠定了坚实的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

一课题背景

二研究内容、目的及意义

三土壤微生物多样性的研究方法进展

2.1纯培养方法

2.2群落生理分析考量土壤微生物多样性

2.3基于rDNA序列的现代分子标记技术分析微生物多样性

2.4展望

四宏基因组学研究策略

3.1宏基因组学概述

3.2样品总DNA的制备

3.3文库分析与筛选

3.4问题与展望

第一章不同红壤理化性质及酶学性质的比较分析

第一节材料和方法

1.1材料

1.2方法

第二节结果与分析

2.1土样含水量及pH值的测定

2.2标准曲线的绘制

第三节讨论

第二章森林红壤的微生物菌群结构及生态学功能分析

第一节材料和方法

1.1材料

1.2方法

第二节结果与分析

2.1土壤总DNA的提取

2.2 16S及18S rDNA的扩增及产物纯化

2.3 rDNA文库的构建

2.4 rDNA文库的RFLP筛选

2.5序列分析和系统发育树的构建

2.6微生物菌群结构及多样性分析

第三节讨论

3.1菌群文库的构建

3.2微生物菌群的功能生态学分析

第三章宏基因组文库的构建和分析

第一节材料和方法

1.1材料

1.2方法

第二节结果与分析

2.1森林土壤总DNA的提取及浓缩

2.2补平DNA的回收

2.3文库包装蛋白滴度检验

2.4文库的质量检测

第三节讨论

第四章宏基因组文库的初步筛选

第一节材料和方法

1.1材料

1.2方法

第二节结果与分析

2.1特异引物的PCR分析

2.2文库克隆的功能筛选策略

第三节讨论

3.1文库总DNA的PCR分析方法的讨论

3.2文库功能筛选策略的讨论

第五章结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历