香根草内生固氮菌的分离、鉴定及其生长特性和回接效应的研究

摘要

固氮微生物具有将氮气转化成氨的能力，称为生物固氮。空气中约80％的氮气不能被植物直接利用，可以通过生物固氮作用间接被植物吸收。据统计，生物固氮量约占全球植物需氮量的3/4。豆科植物与根瘤菌的共生固氮体系是自然界效率较高的固氮体系之一，国内外已进行了相关方面的大量研究。但是大部分粮食作物和经济作物是非豆科植物，关于非豆科植物的生物固氮近年来成为生物固氮领域的研究热点。1975年，DObereiner发现了与禾本科植物联合共生固氮的细菌：固氮螺菌(Azos-pirillum)，并提出根际联合共生固氮的概念。但是由于联合固氮菌与宿主根系之间只是一种“松散”的联合关系，没有分化出特异结构。受多种环境因素的影响，联合固氮效率不及共生固氮高，限制了联合固氮菌在农业中的应用。 内生固氮为生物固氮领域开辟了一个新的方向。内生固氮菌在植物体内的定殖环境适于固氮作用，已有报道表明其固氮酶结构基因在植物细胞内，细胞间隙和木质部导管可以表达。由于内生固氮菌占据着有利的生态位，不仅避免了化合态氮的抑制和土著微生物的竞争，而且可以以不同的方式使植物受益，如直接给宿主提供氮营养和植物生长调节物质。因此，深入研究内生固氮菌的生理生化特性，生长特性以及其与植物宿主之间的相互作用，对于提高非豆科植物生物固氮的效率和发展可持续生态农业具有重要的意义。 本实验利用Ashby无氮培养基从香根草体内分离得到10株细菌，经美国BD phoe-nixTM-100全自动细菌鉴定系统和美国BBL Crystal微生物鉴定系统鉴定，可知菌株MJ-1、MJ-2和MJ-5为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)；MJ-3为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；MJ-4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；MJ-6、MJ-7和MJ-9为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)；MJ-8为肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(Klebsiella pneumoniae subsp.)；MJ-10为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。进一步鉴定了上述各菌株其他方面生理生化特性。采用国际上通用的乙炔还原法检测细菌的固氮酶活性，发现菌株MJ-2和MJ-4固氮酶活性较高。将这两株菌作为目标菌株，以16s rDNA分子作为指标鉴定细菌的系统发育地位，结果表明MJ-2为肠杆菌属阴沟肠杆菌菌种，MJ-4为克雷白氏杆菌属肺炎克氏杆菌菌种。 以MJ-2和MJ-4为待测菌株，探讨氧气，紫外线，以及不同渗透压、氮源、碳源、酸碱度和温度等环境因子对它们生长的影响。结果表明，这两株菌都是兼性厌氧细菌，对紫外线有较强的抵抗力，并且对环境因子的适应范围较广。鉴于香根草对土壤有极强的适应性，能在贫瘠，板结的土壤上照样生长，本实验同时检测了菌株的溶磷性，以便探究香根草对土壤的适应性是否与内生固氮细菌的溶磷性有关。结果表面MJ-2和MJ-4均能在PKO培养基上形成明显的透明圈，具有溶磷性。但是否与香根草对土壤的适应性有关，还需做进一步研究。 取本实验室保存的含pMGFP2.1表达载体的大肠杆菌进行培养。此表达载体含有肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter) Trevisan)M5a1的固氮酶结构基因nifH的启动子和其起始密码子以及发射荧光强度比野生型GFP强100倍的三位点突变GFP(S65A，V68L，S72A)片段。而且pMGFP2.1上还插入卡那霉素(Kan)抗性基因，有助于保持转化子的稳定性。利用三亲交配法将pMGFP2.1导入MJ-4，使用含Kan的Ashby无氮培养基筛选转化子。荧光显微镜下，用蓝光激发，转化子MJ-4发出微弱的绿色荧光。限菌培养条件下，用转化子MJ-4接种香根草无菌苗，培养2周后，取接菌的无菌苗的根，未接菌的根作为对照，做徒手切片。激光共聚焦扫描电子显微镜拍照证实细菌在香根草根组织中存在，而对照没有，并且接菌后植物的鲜重和株高增加量相比对照均有显著提高，说明MJ-4对植物的生长有一定的促进作用。用Ashby无氮培养基从上述回接MJ-4的香根草根内分离固氮细菌，并扩增该菌株16srRNA基因片段，测序实验正在进行中，以此判断回接分离得到的固氮细菌是否为MJ-4。 由此可见，香根草内生固氮菌具有很高的应用价值，本实验为香根草菌肥的开发提供了实践依据.

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

1香根草研究与应用进展

2植物内生细菌的研究进展

3内生固氮菌的研究进展

4研究意义与内容

第一章香根草内生固氮菌的分离、筛选及鉴定

第一节实验材料

第二节实验方法与步骤

1香根草内生固氮菌的分离、纯化

2菌株培养特征的观察

3固氮菌生理生化指标的测定

4固氮酶活性的测定

5 16S rDNA序列同源性分析

第三节实验结果

1菌株形态特征

2菌株生理生化特性

3菌株固氮酶活性

4菌株的系统发育学分析

第四节讨论

第二章环境因子对香根草内生固氮菌生长特性的影响

第一节实验材料

第二节实验方法与步骤

1固氮菌生长曲线测定

2紫外线照射时间对固氮菌生长的影响试验

3渗透压对固氮菌生长的影响试验

4硝酸钾和氯化铵浓度对固氮菌生长的影响试验

5碳源对固氮菌生长的影响试验

6 PH值对固氮菌生长的影响试验

7温度对固氮菌生长的影响试验

8固氮菌溶磷性测定

第三节实验结果

1固氮菌无氮培养条件下的生长曲线

2紫外线照射时间对固氮菌生长的影响

3渗透压对固氮菌生长的影响

4硝酸钾和氯化铵浓度对固氮菌生长的影响

5不同碳源对固氮菌生长的影响

6PH值对固氮菌生长的影响

7温度对固氮菌生长的影响

8溶磷性测定

第四节讨论

第三章香根草内生固氮菌对香根草的促生效应

第一节实验材料

第二节实验方法与步骤

1固氮菌抗生素抗性鉴定

2三亲交配法转化固氮菌

3固氮菌回接香根草实验

4香根草接种固氮细菌后对固氮细菌的分离

第三节实验结果

1固氮菌抗生素抗性鉴定

2报告基因导入固氮细菌

3对接种固氮细菌的香根草进行共聚焦扫描电子显微镜观察

4固氮细菌对香根草的作用

5香根草接种固氮菌后对固氮细菌的分离及鉴定

第四节讨论

结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历