基于RGD-蛛丝蛋白复合纳米纤维构建小直径血管支架的研究

摘要

组织工程血管为解决小直径血管移植物来源提供了有效的途径，是近年来血管损伤修复研究的热点。支架材料在组织工程血管中起关键作用，不仅具有直接支撑细胞的特性，而且影响细胞的生长、迁移、分化以及决定新生组织的结构。复合材料是近年组织工程血管支架材料研究的重点和趋势。
　　 蜘蛛丝纤维的化学本质为蛋白质，因其显著的力学性能、生物可降解性及良好的生物相容性，成为医学组织工程感兴趣的一类特殊的生物材料。根据蜘蛛丝的结构和功能特性，本文在实验室前期通过基因工程技术方法制备蛛丝蛋白，并在蛛丝蛋白的功能重复基因序列中引入RGD（精氨酸.甘氨酸.天冬氨酸）三肽密码子，构建并表达了RGD-蛛丝蛋白（命名为pNSR32，分子量约102KD），生物活性分子RGD三肽是黏附蛋白中能够为细胞表面特异受体蛋白识别的最小短肽序列，是目前应用最广、最有效的促黏附肽。聚己内酯（PCL）是一种新型脂肪族聚酯，以其良好的机械性能、无毒性、可塑性等优良性能广泛应用于生物材料领域。壳聚糖（CS）则有优良的生物相容性和可降解性。本文将pNSR32、PCL和CS三种材料共混，采用静电纺丝技术制备pNSR32/PCL/CS复合纳米纤维小直径组织工程血管支架，并对支架的理化性能以及生物相容性进行评价，得到一种综合性能优良、满足组织工程血管支架要求的新型的生物材料。
　　 本文实验结果如下：
　　 静电纺丝制备pNSR32/PCL/CS复合纳米纤维小直径组织工程血管支架材料各组分的最佳配比和工艺参数分别是：pNSR32、PCL和CS的质量比为10/80/10，电纺过程工艺参数：纺丝液浓度30％、电压80kV、固化距离20cm、挤出速度5 mL/h、转轴内径为4mm条件下获得内径为4mm、长度为8cm、纤维直径粗细均匀的pNSR32/PCL/CS复合纳米纤维小直径血管支架。
　　 傅立叶红外光谱分析表明pNSR32与PCL和CS以物理方式共混，三者物质之间并未形成新化学键；pNSR32/PCL/CS复合纳米纤维小直径血管支架的孔隙率和亲水性分别达到89.6％和85.3％，有利于增加细胞的亲和性；分别选择磷酸盐溶液和含猪胰脂肪酶的磷酸盐溶液，通过残余重量百分考察pNSR32/PCL/CS血管支架的体外降解行为，结果表明pNSR32/PCL/CS支架材料有一定的降解速度，但降解较慢，酶解速度快于水解速度，这是由于支架酶解的同时还有进行水解；力学性能测试结果表明，pNSR32/PCL/CS支架的缝合强度符合手术缝合的要求，支架的抗张强度、杨氏模量和断裂伸长率均优于天然猪冠状动脉。
　　 通过溶血实验、动态凝血时间实验、血小板黏附实验以及复钙化凝血时间对pNSR32/PCL/CS血管支架材料进行血液相容性的评价，实验结果表明支架的溶血率为1.5％，小于5％，符合生物材料的溶血要求：pNSR32/PCL/CS的动态凝血时间实验中支架在前30minBCI下降的较快，之后则缓慢下降；与PCL和PCL/CS相比，pNSR32/PCL/CS复合支架表面黏附的血小板要少；pNSR32/PCL/CS的复钙化时间明显长于PCL，综上实验结果说明pNSR32/PCL/CS小直径血管支架具有良好的血液相容性。
　　 采用MTT的方法考察pNSR32/PCL/CS支架材料的细胞毒性，并通过NIH-3T3细胞与支架复合培养考察其对细胞黏附、生长和分化的影响，评价pNSR32/PCL/CS复合支架的细胞相容性。MTT实验结果表明，与单纯PCL浸提液相比，pNSR32/PCL/CS和pNSR32/PCL复合材料浸提液能较明显促进NIH-3T3细胞的生长和增殖，根据细胞毒性评定标准，分析pNSR32/PCL/CS复合支架材料毒性等级在1级以下，符合生物材料的要求。细胞支架增殖曲线测定结果表明，在PCL材料上增殖速度较慢，而在pNSR32/PCL/CS支架上刚开始增殖较快，以后则因为空间限制细胞增殖速率开始下降。SEM和HE染色观察发现，pNSR32/PCL/CS复合支架更利于NIH-3T3细胞黏附，细胞在材料表面增殖形成多层结构，细胞在复合纳米纤维支架表面生长呈现一定的方向性，但是基本停留在支架表面生长，并未见细胞向支架内部迁移。免疫组化实验结果说明NIH-3T3细胞在各组支架上均可正常表达bFGF因子，但在pNSR32/PCL/CS和pYSR32/PCL含RGD蛛丝蛋白支架材料上呈现更多的bFGF成纤维生长因子，说明RGD-蛛丝蛋白明显改善了血管支架的细胞相容性，有利于种子细胞的黏附、生长和特殊因子的表达。
　　 以大鼠为实验对象，将pNSR32/PCL/CS血管支架或其浸提液移入动物体内，观察机体的炎症反应和毒性反应。pNSR32/PCL/CS复合支架材料以及医用胶原在术后28d材料局部炎性反应消退，炎症细胞基本消失，肌纤维结构排列有序，纤维囊壁趋向变薄，有大量新生血管出现，根据评定标准均呈Ⅰ级-Ⅱ级反应，评价为合格。组织相容性优劣顺序为医用胶原>pNSR32/PCL/CS复合支架材料>PCL支架材料。结果表明pNSR32/PCL/CS复合支架材料具有良好的组织相容性，与组织无排斥作用，能减轻炎症反应。将pNSR32/PCL/CS支架浸提液注射到小鼠体内进行急性全身毒性实验，小鼠在注射支架浸提液的24h，48h，72h后，小鼠体重均有一定程度的增加。实验表明支架浸提液对小鼠无急性毒性作用。初步认为其作为血管组织工程支架材料应用于临床具有一定的可行性。

目录

文摘

英文文摘

中文文摘

绪论

一、血管组织工程

二、血管组织工程支架材料

三、血管组织工程支架的制备技术

四、支架材料的促内皮化修饰

五、组织工程支架材料的生物相容性评价

六、本研究的背景、内容及意义

第一章 pNSR32/PCL/CS复合纳米小直径血管支架的制备

第一节 材料与仪器

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 结论

附图

第二章 pNSR32/PCL/CS复合纳米血管支架理化性能的表征

第一节 材料与仪器

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 结论

附图

第三章 pNSR32/PCL/CS复合纳米纤维小直径血管支架血液相容性的评价

第一节 材料与仪器

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 结论

附图

第四章 pNSR32/PCL/CS复合纳米纤维血管支架细胞相容性的研究

第一节 材料与仪器

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 结论

附图

第五章 pNSR32/PCL/CS复合纳米纤维血管支架体内生物相容性的研究

第一节 材料与仪器

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 结论

附图

第六章 结论

附录 英文缩略词表

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历