PEASC表达载体构建及其农杆菌介导的水稻遗传转化研究

摘要

该研究利用从辣椒上克隆的决定辣椒倍半萜植保素合成的关键酶-倍半萜合成酶(pepper epi-aristolochene synthase)基因(PEASC),构建适合水稻转化的表达载体,在建立起适合于供试水稻品种的农杆菌介导的高效遗传转化体系基础上,进行PEASC的水稻遗传转化,获得转基因水稻植株,这为进一步开展PEASC基因在水稻等主要作物抗病基因工程上可能利用价值评价的研究提供了重要材料.主要研究结论如下:(1)从三种诱导培养基(即NB/MS/2N6)中筛选出适合于供试水稻品种的培养基NB;以NB为基本培养基,进一步筛选出分化培养基并对愈伤分化时间作了较为系统的研究,在此基础上建立起适合于该研究供试水稻品种的遗传转化体系.(2)通过pBSK-PEASC的酶切、电泳、目的片段回收,将克隆在质粒pBSK上的目的基因PEASC克隆到双元表达载体pGA1621的相应酶切位点上,构建出pGA1621-PEASC表达载体.冻溶法将表达载体导入根癌农杆菌EHA105,PCR筛选阳性克隆,获得含有目的基因的工程菌.⑶利用已建的遗传转化体系和工程菌,以水稻胚性愈伤为材料,进行农杆菌介导的遗传转化,共获得32株抗性植株.⑷设计长度分别为20bp和25bp的特异性引物,随机选择8株抗性植株进行PCR检测,从中筛选出6株阳性植株并对其进行Southern blotting分析.结果有两个泳道出现条带:DN950有一株呈阳性,呈单拷贝插入;TJ8有1株呈阳性,呈双拷贝插入.

目录

1前言

1.1植保素研究概述

1.1.1萜类植保素生物合成途径研究

1.1.3倍半萜环化酶基因工程

1.2水稻遗传转化方法评述

1.2.1直接转化法

1.2.2农杆菌介导转化法转化水稻

1.3影响农杆菌介导转化水稻的重要因素

1.3.1农杆菌菌株和载体类型

1.3.2Vir基因的诱导

1.3.3水稻基因型、外植体培养条件

1.4水稻基因工程研究进展

2材料与方法

2.1.实验材料

2.1.1受体水稻品种

2.1.2菌株

2.1.3质粒

2.1.4主要试剂及酶

2.1.5主要仪器设备

2.1.6培养基的配制（具体配制方法见附录）

2.2水稻高频遗传转化再生体系的建立

2.2.1培养基筛选

2.2.2分化培养基的优化

2.2.3水稻愈伤组织继代时间与分化关系

2.3植物表达载体构建

2.3.1构建策略

2.3.2载体构建

2.4农杆菌介导的水稻遗传转化

2.4.1农杆菌EHA105对羧苄青霉素的敏感性实验

2.4.2水稻愈伤组织对潮酶素敏感性实验

2.4.3农杆菌转化水稻

2.5转基因植株的分子检测

2.5.1抗性植株DNA分子的抽提

2.5.2抗性植株基因组PCR鉴定

2.5.3 Southern印迹分析

3结果与分析

3.1水稻高频遗传转化系统的建立

3.1.1三种培养基对四种水稻愈伤组织的影响

3.1.2 NAA与6-BA不同浓度组合（NB培养基）对水稻愈伤分化的影响

3.1.3水稻愈伤继代时间与分化的关系

3.2植物表达载体构建

3.2.1 pGA1621/pBSK-PEAS质粒片段大小的鉴定

3.2.2重组质粒片段大小鉴定

3.2.3农杆菌阳性克隆PCR鉴定

3.3农杆菌介导水稻遗传转化

3.3.1农杆菌菌株EHA1 0 5对羧苄青霉素耐性实验

3.3.2.水稻愈伤组织对潮酶素的敏感性

3.3.3四个水稻品种的转化频率比较

3.4转基因植株分子检测：

3.4.1抗性植株的PCR检测

3.4.2 Southern blotting检测阳性植株

4讨论

4.1关于籼稻和粳稻高效遗传转化体系的建立

4.2植物表达载体的构建

4.3农杆菌介导的水稻遗传转化

4.4影响Southern blotting的因素

5小结

参考文献

致谢

附录2转基因水稻植株获得过程

附录3缩略词及英汉对照

附录4所用试剂与缓冲液的配制