副溶血弧菌耐热直接溶血素基因的克隆表达与鉴定

摘要

根据已发表的副溶血弧菌耐热直接溶血素(TDH)的核苷酸序列设计了一对引物,并在5'-端与3'-端分别增加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,应用PCR技术从致病性副溶血弧菌wVp2株扩增了tdh基因,PCR产物经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切回收后定向插入pGEX-4T-1表达载体,测序分析结果表明tdh基因的开放阅读框(ORF)为570nt,编码由189个氨基酸组成、分子量为23kDa的耐热直接溶血素.应用DNAman、Antheprot 5.0、ClustalW等分子生物学软件分析,显示所克隆的tdh基因与Genebank副溶血弧菌的tdh1基因(M10069)同源率达99.82％,仅在368位与参考菌株有一碱基差别(A-G);推导的氨基酸仅123位由天冬氨酸替代了TDH1的甘氨酸,同源率达99.47％,前24个氨基酸是较强的疏水性区域,可能组成信号肽.将PCR产物与pGEX-4T-1构建的重组质粒成功的转化了E.coli DH5 α与BL21(DE)工程菌株,SDS-PAGE分析表明经IPTG诱导后重组菌在迁移率为49kD位置上出现一条明显的蛋白带,而其载体自身带有26kDGST蛋白带消失,由此推断,49kD蛋白是由tdh基因编码的23kD蛋白与gst基因编码的26kD蛋白连接后形成的融合蛋白.Bio-rad Gel Doc2000,QuantityOne软件分析表明该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白含量的32％,表达产物主要以不溶性蛋白的形式存在于菌体裂解沉淀中,利用5mM二硫苏糖醇、1.5％十二烷基肌氨酸钠和0.2％脱氧胆酸钠等变性剂对不溶性蛋白处理后,能使大部分不溶性蛋白转变为可溶性蛋白,通过Glutathione Sephrose 4B亲和柱层析和Thrombin酶切将GST-TDH融合蛋白从BL21工程菌分离出来.免疫学分析证实纯化的表达产物能被副溶血弧菌胞外产物的特异性抗血清所识别,抗血清的ELISA效价为1:32000,当抗血清稀释度为1:1000时,能检出的最低TDH蛋白量为31.25ng.DNA序列分析和免疫学分析证明所克隆的基因是副溶血弧菌的tdh基因,且重组菌表达的TDH与原始菌株产生的TDH抗原性一致.副溶血弧菌的tdh基因克隆与表达,为在单因子水平上研究副溶血弧菌TDH的毒力、致病机理以及诱导宿主免疫应答方面的作用奠定基础.

目录

ABSTRACT

前言

1.文献综述

1.1副溶血弧菌的流行病学

1.2副溶血弧菌的致病力研究

1.3副溶血弧菌嗜盐机制的研究

1.4快速诊断方法

2.研究目的与意义

材料与方法

1.材料与仪器

2.方法

2.1副溶血弧菌tdh基因的克隆

2.2副溶血弧菌tdh基因的表达

2.3副溶血弧菌tdh基因表达产物的纯化

2.4副溶血弧菌tdh基因表达产物的鉴定

结果与分析

1.PCR扩增与重组表达质粒的构建

2.DNA序列分析

3.副溶血弧菌wVp2株tdh基因编码的蛋白质分析

4.副溶血弧菌TDH蛋白基因在大肠杆菌中表达

4.1融合蛋白的诱导表达

4.2融合蛋白的可溶性分析

5.副溶血弧菌wVp2株tdh基因表达产物的变复性与纯化

5.1副溶血弧菌wVp2株tdh基因表达产物的变复性

5.2副溶血弧菌wVp2株tdh基因表达产物的纯化

6.副溶血弧菌tdh基因表达产物免疫学特性的研究

6.1兔抗融合蛋白血清和兔抗wVp2株胞外产物血清的效价

6.2 ELISA鉴定tdh基因表达产物的免疫原性

6.3 ELISA棋盘滴定法测定兔抗wVp2株胞外产物血清的灵敏度

讨论

1.副溶血弧菌耐热直接溶血素基因的扩增

2.副溶血弧菌耐热直接溶血素基因的克隆

3.副溶血弧菌耐热直接溶血素基因的表达

4.不溶性表达产物的溶解

5.融合蛋白的纯化

6.基因工程表达的TDH免疫学特性的研究

7.后续研究

参考文献

附录

我的答谢词--写在毕业前夕，写下一生铭记