龙眼遗传资源的RAPD与POD同工酶分析

摘要

龙眼是福建重要的亚热带特色水果。然而，人们对龙眼的遗传背景了解甚少，生产上存在的品种老化、良莠不一等突出问题，严重限制了龙眼的资源开发利用和生产的发展。前人应用同工酶、RAPD分析等标记对小样本的龙眼遗传资源进行了初步研究，而在整个有代表性的遗传资源的分析却未见报道。因此有必要应用RAPD分子标记技术结合POD同工酶分析技术对龙眼的遗传资源进行较为全面的遗传资源分析。本研究优化了龙眼POD同工酶提取和电泳体系；摸索出适合龙眼叶片基因组DNA的提取方法；建立和优化了龙眼RAPD反应体系；采用RAPD分子标记技术，辅以POD同工酶分析，结合聚类分析，对以福建龙眼遗传资源为主的95份国内外龙眼遗传资源，进行了遗传资源的遗传多样性和亲缘关系分析。主要研究结果如下： 一、龙眼POD同工酶提取和电泳体系的优化。针对POD同工酶酶的活性和酶带数受到材料新鲜度、提取液的成分、电泳和染色方法的影响，经过反复试验，改进确立了龙眼POD同工酶提取和电泳的优化体系，首次确定供试材料以叶龄为3～6月龄的龙眼叶片为佳，以低浓度的磷酸缓冲液(0.05mol/LpH7.5的PBS加0.1％的Triton)为宜。同工酶电泳采取聚丙烯酰胺凝胶电泳法，染色方法采用醋酸-联苯胺染色法。改进优化的龙眼POD同工酶提取和电泳的体系，使以往只能获得的POD同工酶酶谱从8条增加到17条。 二、龙眼遗传资源亲缘关系的POD同工酶分析。整个酶谱共产生17条酶带划分为4大酶区。其中第Ⅰ酶区和第Ⅲ酶区是龙眼POD的活性区，在这两个区域的酶带比较固定，且活性大。第Ⅱ酶区和第Ⅳ酶区是龙眼POD的弱性区，所产生的酶带活性较弱。第二条、第三条酶带(迁移率分别为0.220、0.253)是龙眼样品的特征谱带。POD同工酶聚类分析结果把95份龙眼遗传资源分为2个品种类群并细分为7组。 三、龙眼叶片DNA提取方法的建立。针对龙眼叶片富含单宁和多糖的特性，采用两种提取DNA的方法：一种把Tris替代Tris-HCl的改良CTAB法；另一种为加溶解液先除掉可溶性多糖再加入裂解液的改良CTAB法。两种方法都能有效地克服多糖等物质的干扰，更加简便地从龙眼叶片提取较高质量和产量的DNA。 四、龙眼RAPD-PCR反应体系的优化。在参考一般RAPD分析的反应程序的基础上，经过反复试验，确立适宜的PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃1min，38℃40s，72℃2min，共45个循环，最后置4℃保温。优化的龙眼RAPD-PCR反应体系为：25μL反应总体积中，包括龙眼模板DNA25ng，Mg2+浓度为1.5mmol/L，2.5mmol/μLdNTP2μL，10×Buffer2.5μL，引物2.0×103nmoL-1，采用的Taq酶浓度为1.25U。 五、龙眼遗传资源的RAPD分析。选用上海Sangon公司的200条随机引物，筛选出多态性明显的18条引物，对龙眼95份遗传资源进行PCR扩增，每个引物均能够产生清楚的条带。共产生197条扩增带，平均每个引物产生的条带为10.944；不同引物获得的扩增带7～15不等，其中最多的S207，为15条；最少的是S234产生7条扩增带；DNA扩增带的多态性为100％，这表明95份材料的遗传多样性高。根据ED法计算各样品间的遗传相似系数，采用UPGMA法进行龙眼品种或种类分析，建立亲缘关系聚类树状图。以结合距离D=0.80为界，本研究可以将95份龙眼遗传资源区分为中国龙眼和泰国龙眼2个品种类群。以D=0.4为界时，把供试的89份中国龙眼遗传资源分为11组。 六、苗木鉴定和品种的区分。采用POD同工酶分析和RAPD分析相结合技术，可以判定乌龙种与乌龙岭、凤梨穗与凤梨味其遗传距离较远，应属于不同品种类型，而虎眼与福眼则为同物异名。表明该技术可以很好的解决龙眼苗木鉴定、同物异名、同名异物辨别的难题。 七、13个东壁龙眼株系的分析。采用Sangon22条长度为10个碱基的引物对13个东壁龙眼的优良株系进行RAPD分析。13个样品扩增出124条扩增带，不同引物获得的扩增带3～9条不等，S299最少，只有3条，S60最多，有9条，平均为5.64条。而POD同工酶电泳图谱上13个样品基本一致。通过POD同工酶和RAPD分析结果可以知道13个东壁龙眼在遗传上有着非常高的相似系数，证明了他们之间在遗传上保持着较高的稳定性；但是RAPD分析结果表明，随着环境和时间的变化，其中6个株系产生了基因变异。研究结果还进一步证明，RAPD分子标记优于POD同工酶分析，对资源的遗传分析更加科学。本试验研究确立和优化了龙眼同工酶的反应体系，为将来开展龙眼及其它亚热带果树同工酶的研究工作提供了技术参考；RAPD辅以同工酶分析为龙眼的杂交育种、引种、品种选育和鉴定等提供了技术支持；研究结果在今后进一步开展龙眼遗传和分类研究上具有一定的理论意义；研究确定的重要龙眼遗传资源在今后开发利用中，具有良好的实际应用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

独创性声明及论文使用授权的说明

第一章引言

第二章龙眼POD同工酶分析

第三章龙眼的RAPD分析

第四章讨论

参考文献

附录

致谢