瓜类尖孢镰刀菌生理分化特性研究

摘要

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Sch1．)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛。瓜类是福建省重要的经济作物，近年来，随着栽培面积的不断扩大及设施栽培的推广，致使瓜类枯萎病发生严重。 从诏安县、永泰县等瓜类生产基地的黄瓜、甜瓜和西瓜上采集的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)菌株中选出20株具有代表性的菌株，利用β-D-葡萄糖苷酶活性测定、致病性测定和鉴别寄主划分其专化型，并从营养体亲和群(VCGs)、rDNA-ITS区序列分析和脂肪酸指纹图谱(FAME)分析等方面对菌株的生理分化特性进行系统的研究，探讨专化型与VCGs、rDNA-ITS区序列和FAME之间的相关性。 利用致病性测定与β-D-葡萄糖苷酶活性测定相结合的方法，将福建省瓜类作物(黄瓜、甜瓜和西瓜)的尖孢镰刀菌致病菌区分为3个专化型：尖孢镰刀菌黄瓜专化型(F.oxysporum f.sp．cucumerium)，尖孢镰刀菌甜瓜专化型(F.oxysporum f．sp．melonis)和尖孢镰刀菌西瓜专化型(F.oxysporum f.sp,sp.niveum)。 应用0-1数据系统聚类方法与菌株营养亲和性测定相结合划分菌株的营养个体亲和群(VCGs)。供试的20个菌株可分为7个VCGs，黄瓜上分离的菌株包含2VCGs，甜瓜上分离的菌株包含3个VCGs，西瓜上分离的菌株包含2个VCGs。菌株的VCGs与专化型之间呈现以下关系：不同专化型菌株间无营养体亲和性；同一专化型中可能具有多个vCGs；同一寄主致病菌株与非致病菌株间无亲和性。 研究结果表明：尖孢镰刀菌rDNA-ITS区序列难以区分菌株专化型。所供试的瓜类尖孢镰刀菌不同专化型菌株的ITSl和ITS2区间的同源性均为100％。 尖孢镰刀菌脂肪酸气相色谱典型的模式图谱及菌株脂肪酸峰值变化规律分析结果：菌株的模式图色谱有效峰从保留时间1.651为起点到保留时间16.200为终点。大部分菌株脂肪酸峰从十四碳脂肪酸(C14:0)开始，到十八碳脂肪酸(C18:0)结束，具有4个特征性色谱峰。通过主成分分析发现C14:0和C15:0这两个小峰所反映的峰值变化可能成为区分不同菌株的指标。利用FAME分析可以揭示菌株间存在生理分化现象，但目前尚无法利用FAME鉴定尖孢镰刀菌不同的专化型。

目录

声明

摘要

1.引言

1.1尖孢镰刀菌的生理分化与鉴定

1.1.1尖孢镰刀菌的分布与为害

1.1.2专化型与生理小种

1.1.3形态学及培养性状鉴定

1.1.4鉴别寄主鉴定

1.1.5同功酶分析

1.1.6分子检测技术

1.2尖孢镰刀菌的营养体亲和群

1.2.1营养体亲和群测定

1.2.2 VCG与专化型的关系

1.2.3 VCG与生理小种的关系

1.2.4 VCG与DNA多态性的关系

1.3脂肪酸指纹图谱的分析与应用

1.4本研究的研究内容、目的及意义

2.材料与方法

2.1瓜类枯萎病菌的采集、分离与菌种保存

2.1.1枯萎病原菌的采集

2.1.2枯萎病原菌的分离

2.1.3枯萎病原菌的菌种保存及活化培养

2.2瓜类尖孢镰刀菌的专化型鉴定

2.2.1形态学特征

2.2.2培养特性

2.2.3致病性测定

2.2.4 β-D-葡萄糖苷酶活性测定

2.2.5菌株致病物质与β-D-葡萄糖苷酶活性与致病性关系

2.2.6寄主专化型

2.3瓜类尖孢镰刀菌的营养亲和群分析

2.3.1供试菌株

2.3.2培养基

2.3.3抗氯酸盐突变体的诱发与分离

2.3.4 nit突变株鉴定及突变类型分析

2.3.5菌株的自身营养亲和性测定

2.3.6菌株间营养体亲和群测定

2.4瓜类尖孢镰刀菌的rDNA-ITS区序列分析

2.4.1供试菌株

2.4.2生化试剂

2.4.3菌株的DNA提取

2.4.4 rDNA-ITS区扩增

2.4.5PCR产物的直和比对分析接测序

2.5瓜类尖孢镰刀菌的脂肪酸指纹图谱分析

2.5.1供试菌株

2.5.2培养基

2.5.3药品试剂

2.5.4脂肪酸的提取方法

2.5.5脂肪酸的检测

2.5.6菌株的脂肪酸特征图谱分析

2.5.7菌株的脂肪酸的峰值变化规律分析

2.6统计分析方法

3.结果与分析

3.1瓜类尖孢镰刀菌菌株及其在植株体内的分布

3.1.1瓜类枯萎病原菌菌株分离、鉴定与菌种保存

3.1.2枯萎病原菌在瓜类植株体内的分布

3.2瓜类尖孢镰刀菌的专化型鉴定

3.2.1形态学特征

3.2.2培养特性

3.2.3致病性测定

3.2.4 β-D-葡萄糖苷酶活性分析

3.2.5菌株致病性与β-D-葡萄糖苷酶活性的相关性分析

3.2.6寄主专化型

3.3瓜类尖孢镰刀菌菌的营养亲和群分析

3.3.1抗氯酸盐突变体的诱发与分离

3.3.2 nit突变株鉴定及突变类型分析

3.3.3菌株的自身营养亲和性测定

3.3.4营养体亲和群测定

3.4瓜类尖孢镰刀菌的rDNA-ITS序列分析

3.5瓜类尖孢镰刀菌的脂肪酸指纹图谱分析

3.5.1菌株的脂肪酸模式图谱分析

3.5.2菌株的脂肪酸峰值变化规律

4.小结与讨论

4.1瓜类尖孢镰刀菌致病性与β-D-葡萄糖苷酶活性的相关性分析

4.2福建省瓜类尖孢镰刀菌专化型鉴定

4.3尖孢镰刀菌营养体亲和群与专化型的关系

4.4尖孢镰刀菌rDNA-ITS区序列与专化型的关系

4.5尖孢镰刀菌脂肪酸指纹图谱分析及其在专化型研究中的应用

5.结论与展望

参考文献

致谢

附录