怀牛膝连作促进效应及其分子机理研究

摘要

本研究在实地调查怀牛膝具有很强的化感连作促进作用的基础上，采集连作多年怀牛膝土壤，运用生物测试方法、抑制消减杂交技术和差异蛋白质组学，探讨连作多年怀牛膝土壤的化感物质对下茬怀牛膝的连作促进效应及其作用机理。其结果如下： 通过水浸提和有机溶剂萃取法得到连作多年怀牛膝土壤的化感物质，应用培养皿-滤纸生物测试法进行连作化感物质对模式植物莴苣的作用效果分析。结果显示，连作土壤的化感物质对模式植物莴苣的生长促进效果明显，各处理对莴苣的作用率(Effect rate，ER)均大于25％，尤其是水浸提处理的作用效果最明显，其促进率大于100％。在生物测试基础上优选出了三个水浸提处理浓度进行怀牛膝连作模拟，探讨连作多年怀牛膝土壤的化感物质所引起下茬怀牛膝在基因表达和蛋白质翻译水平上的表达差异，及其对下茬怀牛膝促进生长的分子机理。 抑制消减杂交技术分析结果显示，怀牛膝根系分泌物能明显诱导下茬怀牛膝的基因差异表达。通过SSH技术构建了怀牛膝在连作条件下的正向SSH-cDNA文库，通过菌液PCR、质粒验证和反向Northen杂交验证后共得到45个阳性克隆。经过cDNA测序，除去部分重复序列和未知序列后得到10个上调表达的基因。差异片段有参与植物光合作用相关的基因片段和基因表达调控的基因片段，还检测到与植物甾醇和黄酮类合成相关的基因片段，也有参与糖基化转运的基因片段。抑制消减杂交技术从转录水平上揭示了连作多年怀牛膝土壤的化感物质能明显促进下茬怀牛膝的初级代谢过程，并能激发植物甾醇类和黄酮类物质代谢，这可能是怀牛膝连作化感促进作用的一个重要的因素。 进一步，运用差异蛋白质组学研究结果显示：连作土壤水浸提液处理怀牛膝幼苗能明显诱导其机体内蛋白质的特异表达，具体表现在共有25个蛋白质表达丰度发生明显变化，其中15个蛋白表达发生上调，10个蛋白质表达发生下调，这些蛋白质主要与植物的营养吸收代谢，植物次生代谢和抗逆性，信号转导以及核酸与蛋白质的合成相关。从上调的蛋白而言，有与植物信号转导相关的如F-BOX、生长素诱导蛋白和生长素响应蛋白，有与植物抗性和内源次生代谢相关的如茶尔酮合成酶、脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶等，有与植物营养代谢相关如磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶激酶、K-ATP转移酶等；而发生下调的蛋白质有与植物氮素利用相关的如丙酮酸脱氢酶激酶和谷氨酰胺合成酶等。可见，连作化感物质不仅诱导了下茬怀牛膝体内甾醇类和黄酮类物质代谢过程，还能明显激发机体内信号系统，诱导生长素类激素的分泌，进而促进下茬怀牛膝对营养物质的吸收和物质合成，并调节次生代谢物质的分配运输，从而促进怀牛膝的根部膨大和药用活性成分在根部的累积，进而提高怀牛膝的品质和产量。 由此本文认为，前茬怀牛膝机体代谢形成的化感物质在土壤中累积，也可能经过内生微生物或土壤中微生物转化和放大作用积累于土壤，会激发下茬怀牛膝机体内的某种信号系统，诱导相关基因的表达和蛋白质翻译，在代谢水平上作出响应，从而调节机体内的激素水平，利用激素调节从分子水平上活化怀牛膝机体细胞分裂和生长提高怀牛膝对营养物质的吸收利用和机体合成物质的分配运输，从而调节怀牛膝生长，使得其地下根变粗变长，药用活性成分的提高。这可能是怀牛膝化感连作促进作用的一个重要化学生物学与分子生态学原因。

目录

声明

摘要

前言

1.药用植物连作障碍与怀牛膝连作促进

1.1药用植物连作障碍普遍存在

1.2怀牛膝生物学我及其显著的连作促进作用

2.抑制消减杂交技术介绍

2.1减法杂交(subtractive hybrdization)

2.2 mENA差异显示PCR(mRNA differential display reverse transcription PCR)

2.3基因芯片技术

2.4抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridzation,SSH)

3.蛋白组学简介

3.1蛋白组学及其技术产生的背景

3.2蛋白组学研究策略与技术

3.3利用差异蛋白组学研究药用植物连作的优点

4.本研究的特点与意义

材料与方法

1.土壤采集及土壤预处理

2.怀牛膝连作促进作用潜力分析

3.怀牛膝幼苗培养及取样方法

4.怀牛膝连作促进的差异基因表达的抑制消减杂交分析

5.怀牛膝连作促进的差异蛋白质组学研究

结果分析

1.土壤浸提液对模式植物莴苣的根部伸长的效应分析

2.怀牛膝连作促进的差异基因的抑制消减杂交分析

3.怀牛膝连作促进的差异蛋白质组学研究

结论与讨论

问题与展望

参考文献

附录

致谢