辣椒应答疫霉的转录谱分析及相关候选抗病基因的cDNA分离

摘要

辣椒疫病(Phytophthora blight)是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici.Lone.)侵染引起的真菌性病害，是辣椒生产上一种毁灭性病害。研究辣椒疫病病原菌侵染诱导下的辣椒基因表达谱并分离、鉴定相关的候选抗病基因，对于阐明辣椒的抗病机制及其遗传改良具有重要意义。本研究运用cDNA-AFLP技术研究辣椒应答疫霉菌侵染的转录图谱，其中对363个衍生转录片段(transcript-derived fragment TDF)测序并进行了功能注释，从由辣椒叶片提取的总RNA构建的cDNA文库中筛选出3个全长cDNA，并对基因进行实时荧光定量PCR。主要结果如下： 1、采用cDNA-AFLP技术，得到辣椒响应疫霉差异表达的转录谱，并对图谱中有差异变化的363个TDF测序，测序结果在NCBI上进行同源性分析，117个没有找到同源序列，246个找到了同源序列，比例为67.8％，对TDF差异表达情况进行分类发现无变化172个、各种下调(D)79个、早期上调(E)28个、晚期上调(L)7个、其它形式上调(I)77个。这些基因主要有：小GTP结合蛋白，钙依赖蛋白激酶，铁氧还蛋白，抗坏血酸还原酶，类调渗蛋白，亚精胺合成酶，细胞色素P450，油酸脱氢酶，过氧化物酶，蛋白质二硫键异构酶。 2、采用SMARTTM cDNA文库构建试剂盒，构建了辣椒响应疫霉cDNA文库，其滴度达到了1×106pfu/mL，重组率达到90％以上。 3、采用基于PCR技术的96孔板cDNA文库筛选法，利用测序得来的基因片段设计引物，筛选cDNA文库获得了三个可能与抗病性密切相关：抗菌蛋白(EU401721)、Rubisco活化酶(EU401722)和硫堇蛋白(EU367112)的全长cDNA。测序结果表明，抗菌蛋白全长为645bp，含有长度为85个氨基酸的开放读码框，同源分析结果表明，所分离的cDNA与已发表的抗菌蛋白具有不同程度的同源性，抗菌蛋白(EU401721)与辣椒抗菌蛋白(AAL73184)同源性为98％，与苦瓜几丁质酶(ABD66068)的同源性为57％，与籼稻(ABU25226)几丁质酶的同源性为60％，与银合欢(AAM49597)几丁质酶的同源性为53％；Rubisco活化酶长度为1741bp，含有长度为439个氨基酸的开放读码框，同源分析结果表明，Rubisco活化酶(EU401722)与西红柿(AAC15236)Rubisco活化酶的同源性为92％，与马铃薯(ABX84141)Rubisco活化酶的同源性为81％；硫堇蛋白(EU367112)长度为608bp，含有长度为91个氨基酸的开放读码框，同源分析结果表明，硫堇蛋白与辣椒(AAF16413)硫堇蛋白的同源性为71％。与辣椒(AF112443)硫堇蛋白的同源性为71％。 4、应用实时荧光定量PCR，对三个候选基因在辣椒疫霉菌作用下的cDNA-AFLP分析结果进行验证，并研究了它们在辣椒疫霉、UV-B、JA、SA、JA+SA、NaCl、4℃低温和机械损伤等逆境或外源激素作用下的表达，结果表明：荧光定量的实验结果与cDNA-AFLP的实验结果基本一致。抗菌蛋白表达量较为显著的是NaCl处理的12h和机械损伤的24h，疫霉侵染后则在60h达到最大，Rubisco活化酶基因是紫外线处理对其影响最大，硫堇蛋白基因与辣椒应答激素密切相关，疫霉侵染辣椒植株后硫堇蛋白基因表达量逐渐增强。 本研究结果对于辣椒抗疫霉的分子机制剖析及差异表达TDF相应基因在辣椒应答疫霉侵染中的可能作用研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章前言

1、辣椒疫病的研究进展

2、cDNA-AFLP在植物抗病研究中的应用

3、本研究的目的及意义

第二章辣椒应答疫霉侵染的cDNA-AFLP分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1cDNA-AFLP技术体系的建立

2.2辣椒叶片在辣椒疫霉侵染作用下的基因表达分析

3讨论

3.1cDNA-AFLP技术的几点关键环节

3.2辣椒应答疫霉侵染的表达谱的分析

第三章辣椒应答疫霉侵染的cDNA文库的构建及候选基因的克隆

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1文库构建的质量保证

2.2基于PCR技术的96孔板基因筛选法

2.3目标克隆的测序与分析

3讨论

3.1 96孔板文库筛选的效率

3.2候选基因的功能分析

第四章候选基因表达的实时荧光定量PCR分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1内参基因及候选基因荧光定量PCR条件优化

2.2标准曲线的建立

2.3候选基因的表达分析

3讨论

3.1影响荧光定量PCR效果的重要因素

3.2三个候选基因荧光定量分析

附录

参考文献

致谢