H5N1亚型禽流感病毒PB1_P亚基片段的表达、纯化和结晶

摘要

禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病,在世界范围内给养禽业造成巨大损失,国际动物卫生组织已将其列为A类动物传染病。自1997年香港发生全球首例AIV直接感染人并致死的事件以来,迄今已造成数百人死亡,成为重大公共疫情。所以,加强对禽流感病毒的研究具有重要的现实意义。
　　 流感病毒聚合酶PB1亚基的中间区域,即聚合酶区域(PB1_P)具有RNA聚合酶活性,直接负责病毒的转录和复制,是聚合酶的核心区域。本实验着重研究H5N1亚型禽流感病毒PB1_P亚基片段,即PB1亚基上第197-554个氨基酸,在大肠杆菌中的表达情况,纯化出高纯度的重组蛋白,并进行了蛋白初步结晶。
　　 根据Genbank中H5N1亚型禽流感的PB1的cDNA序列,设计特异性引物,利用RT-PCR反应扩增H5N1亚型禽流感的PB1_P基因,克隆到pET-28a载体中,经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后,筛选到阳性重组子pET-28a/PB1_P质粒。同源性比较分析得知,PB1基因序列高度保守,具有型特异性,同亚型病毒间相似率达99％。将阳性重组子转化大肠杆菌BL21获得稳定表达的阳性工程菌。以PB1P最佳表达条件IPTG浓度:0.5mM;诱导温度:37℃;诱导时间:4h获得重组蛋白。pET-28a/PB1_P,通过Western-blot鉴定。用镍亲和层析、琼脂糖凝胶层析对重组蛋白进行纯化,用Lowry法测定蛋白含量。采用悬滴气相扩散法对蛋白进行结晶,得到两种条件下的初筛晶体。
　　 结论：
　　 (1)成功构建pET-28a/PB1_P重组质粒:
　　 (2)纯化出高浓度PB1_P重组蛋白,得到初筛晶体。为进一步研究流感病毒聚合酶的功能和结构、开发新型诊断试剂盒奠定了良好的基础。