增强金黄色葡萄球菌荚膜多糖CP5和CP8免疫原性技术的研究

摘要

一直以来,奶牛乳腺炎严重影响到奶牛产业的发展,而金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要病原菌之一,从患乳腺炎的奶牛分泌的乳汁中分离出的金葡菌94％-100％的细菌细胞壁带有荚膜,70％-80％的金黄色葡萄球菌产生5型或8型荚膜多糖,因此造成奶牛金黄色葡萄球菌乳腺炎的主要因素被认为是CP5和CP8。金黄色葡萄球菌表面的荚膜多糖与细菌的毒力和抗吞噬作用有关,致使金葡菌不能被免疫系统有效清除。
　　 研制能够刺激机体产生免疫应答和免疫记忆反应的特异性荚膜多糖疫苗可能是预防奶牛乳腺炎的有效途径之一,然而荚膜多糖属于小分子,是不完全抗原,不能刺激机体产生免疫应答和免疫记忆反应,因此不能作为独立的抗原使用。通过化学方法利用载体蛋白与荚膜多糖偶联,制备能够刺激机体产生特异性荚膜多糖抗体的大分子偶联物,提高小分子荚膜多糖的免疫原性的技术在国内外已有报道。
　　 在试验过程中,我们以己二酰肼为间桥,碳二亚胺为偶联剂,将荚膜多糖与不同的载体蛋白偶联制备大分子结合物。由于细菌的鞭毛蛋白具有佐剂作用,可以增强免疫应答,因此在载体的选择方面,我们以鞭毛蛋白为主要的研究对象,研究其对荚膜多糖免疫原性的影响。为了提高鞭毛蛋白中赖氨酸的含量,我们在鞭毛蛋白的N末端加上一个多聚赖氨酸,以提高多糖衍生物对鞭毛蛋白的攻击力,形成连续的多糖片段。由于连续的多糖片段和鞭毛蛋白的佐剂作用,我们可以得到更为有效的偶联物。
　　 在偶联物的鉴定过程中,主要用薄层层析、Sepharose CL-6B层析图谱、苯酚硫酸法测定多糖含量和酶联免疫吸附试验等方法对偶联物进行鉴定,结果证明偶联物偶联成功,并确定了偶联率。
　　 用金黄色葡萄球菌荚膜多糖偶联物免疫小鼠,免疫采血后,采用间接ELISA法、MTT法和小鼠攻毒试验检测荚膜多糖偶联物的免疫原性和攻毒保护作用。通过间接ELISA法检测小鼠的抗体水平,结果显示,二免后两周,多糖偶联物均表现出免疫原性,诱导小鼠产生特异性IgG、IgM荚膜多糖抗体,三免后的IgG抗体水平显著高于二免小鼠的抗体水平,说明说明偶联物小鼠产生了免疫记忆反应。而单独的多糖组,在第三次免疫后,没有发生明显的抗体水平的提高,同时也没有产生免疫记忆反应。在用多糖偶联物免疫的小鼠中,用Lys-flic-cp免疫小鼠的抗体水平显著的高于用flic-cp、flic-m-cp和BSA-cp免疫小鼠的抗体水平,flic-cp组小鼠的抗体水平显著高于flic-m-cp和BSA-cp组小鼠的抗体水平,这说明lys-flic和flic具有免疫佐剂作用,能够增强荚膜多糖偶联物的体液免疫效果,同时lys-flic的佐剂作用较flic显著增强。
　　 在对小鼠的细胞免疫的研究过程中发现,金黄色葡萄球菌荚膜多糖5型和8型均对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖表现出一定的促进作用,然而,荚膜多糖与蛋白载体偶联后,偶联物极显著的促进了小鼠T淋巴细胞的增殖。其中lys-flic-cp较flic-cp、bsa-cp和flic-m-cp印具有更为显著的促进T淋巴细胞增殖的作用,flic-cp较bsa-cp和flic-m-cpT淋巴细胞增殖作用也显著提高,这表明lys-flic具有比flic更强的免疫增强作用。
　　 本试验中,我们对三免后的小鼠,在三免后的第14天进行攻毒保护试验,攻毒结果表明,荚膜多糖偶联物免疫小鼠的成活率高于单独的多糖对照组,其中cp与lys-flic偶联物免疫小鼠的成活率最高,提示lys-flic的免疫增强作用。