两种植物呼肠孤病毒的小管蛋白鉴定及其功能结构域研究

摘要

近几年,由水稻呼肠孤病毒引起的水稻病害普遍流行,其中水稻南方黑条矮缩病和水稻锯齿叶矮缩病是爆发最严重的病害,给我国的水稻生产带来了巨大的损失。这两种病害的病原体分别为南方水稻黑条矮缩病毒(Southern riceblack-streaked dwarf virus,SRBSDV)和水稻锯齿叶矮缩病毒(Rice ragged stuntvirus,RRSV)。目前,国内外学者研究了SRBSDV和RRSV的发生及危害、病害症状、品种抗性及流行因为、预测及防治、寄主和传播介体、病原及病原血清学、分类地位、基因组结构与功能、与寄主和介体间的互作关系等方面,但对于病毒如何侵染寄主、在寄主体内如何复制增殖和传播扩散机制等尚不清楚。因此从蛋白功能研究病毒的侵染运输通道对防控病害的发生有十分重要的作用。
　　 通过RT-PCR扩增了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7两个基因序列,分别将其构建到杆状病毒真核表达载体pDEST8上,通过筛选鉴定获得目的载体重组子pDEST8-SRBSDV-P7-1和pDEST8-RRSV-P7。再将它们转化大肠杆菌DH10Bac中重组产生杆状病毒表达系统中所需的重组穿梭质粒Bacmid-SRBSDV-P7-1和Bacmid-RRSV-P7。Bacmid质粒转染至sf9昆虫细胞中,使SRBSDV-P7-1和RRSV-P7在细胞中表达。通过免疫荧光观察目的基因在细胞中的表达情况、Western blot检测目的基因在细胞中的表达和电镜观察目的蛋白的结构形态。结果表明,SRBSDV-P7-1和RRSV-P7在sf9细胞中都得到了正确表达,且它们在细胞中都形成小管状结构,小管呈网状分布,能伸出细胞膜延长至相邻细胞；电镜观察提纯的小管状蛋白直径约85nm,呈圆筒状内部中空,分布于细胞中。这说明了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7即为两种病毒中的小管蛋白。
　　 为了进一步了解小管蛋白的主要功能结构域,生物信息学分析了两个蛋白的结构,预测其跨膜区。利用缺失突变体方法研究跨膜区和末端保守区对小管形成和功能的影响,分别构建了缺失SRBSDV-P7-1和RRSV-P7的跨膜区和N端、C端蛋白序列的突变体,获得了重组穿梭质粒Bacmid-P7-1-ΔTM1、Bacmid-P7-1-ΔTM2、Bacmid-P7-1-ΔTM3、Bacmid-P7-1-ΔN、Bacmid-P7-1-ΔC和Bacmid-P7-ΔTM、Bacmid-P7-ΔN、Bacmid-P7-ΔC,转染sf9细胞使之表达,免疫荧光处理表达细胞后共聚焦显微镜观察缺失突变体表达情况。结果表明,SRBSDV-P7-1和RRSV-P7缺失跨膜区和末端序列后在细胞中均不再形成管状结构,说明跨膜区和末端保守区都参与小管蛋白的形成,对小管功能的发挥起着十分重要的作用。
　　 综上所述,通过Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统表达了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7两个预测的小管蛋白及其它们的缺失突变体；利用’Western blot检测了蛋白表达:利用免疫荧光方法处理表达细胞后共聚焦显微镜观察蛋白表达情况；利用电镜观察了提纯后的小管蛋白结构形态。本研究进一步明确了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7蛋白的功能,鉴定了SRBSDV和RRSV中的小管蛋白,分析了小管蛋白的功能结构域,为了解SRBSDV和RRSV的复制增殖机制和侵染扩散机理提供了依据,更为开发防治病害途径奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1 南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)与水稻锯齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)的研究概况

1.1 南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的研究概况

1.2 水稻锯齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)的研究概况

2 病毒中有关小管蛋白的研究概况

3 病毒侵染寄主及扩散机制的相关研究进展

4 杆状病毒真核表达系统的研究概况

4.1 杆状病毒真核表达系统的原理

4.2 杆状病毒真核表达系统的优缺点

4.3 杆状病毒真核表达系统的应用

5 本研究的目的和意义

第二章 植物呼肠孤病毒SRBSDV与RRSV小管蛋白的鉴定

1.SRBSDV-P7-1与RRSV-P7杆状病毒真核表达载体的构建

1.1 材料与方法

1.2 结果与分析

1.3 小结与讨论

2.SRBSDV-P7-1和RRSV-P7在sf9细胞中的表达

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 小节与讨论

3.Western blot检测SRBSDV-P7-1和RRSV-P7在sf9细胞中的表达

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 小节与讨论

4.小管蛋白的提纯及电镜观察小管蛋白结构

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 小节与讨论

第三章 呼肠孤病毒SRBSDV和RRSV小管蛋白的功能结构域分析

1 生物信息学分析SRBSDV和RRSV小管蛋白的跨膜区域

1.1 材料与方法

1.2 结果与分析

1.3 小节与分析

2.SRBSDV和RRSV小管蛋白缺失突变体的杆状病毒真核表达载体的构建

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 小结与讨论

3.SRBSDV-P7-1和RRSV-P7缺失突变体在sf9细胞中的表达

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 小结与讨论

第四章 全文总结与展望

参考文献

致谢