中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)芽休眠的分子机制研究

摘要

中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）为石蒜科水仙属，是我国十大传统名花之一，也是具有较高的观赏价值、经济价值和药用价值的夏休眠植物。在栽培过程中，温度对中国水仙的生长发育、休眠诱导与解除具有非常重要的作用。本研究以中国水仙3年生鳞茎为材料，在探明鳞茎芽休眠期的基础上，通过构建休眠诱导和发生过程中转录组数据库，获得中国水仙芽休眠相关基因，进一步研究温度与中国水仙鳞茎芽休眠的关系及中国水仙芽休眠相关基因的表达分析，并进行中国水仙芽休眠相关基因遗传转化的初步研究，以探讨中国水仙芽休眠的分子机制，为研究中国水仙芽休眠机理和生产实际提供参考。主要研究结果如下：
　　1.中国水仙鳞茎芽休眠期的确定。
　　以中国水仙3年生鳞茎为材料，对其进行形态学、解剖学、淀粉粒的观察和分析，结合可溶性糖含量的测定，结果表明：中国水仙鳞茎芽休眠期自5月上、中旬至7月上、中旬，为期2个月，介于中国水仙鳞茎膨大期和花芽分化期之间，包括休眠前期和休眠后期2个时期。中国水仙鳞茎膨大期，叶片绿色，根系活力强；鳞茎芽细胞核活力强；鳞片细胞内淀粉粒逐渐增大增多，脐点开始出现；可溶性糖含量降低。休眠期叶片逐渐枯萎，根系活力强，鳞茎的重量和茎宽达到最大值，细胞核活力由弱变强，鳞片内部细胞淀粉粒和脐点先于上、下表明细胞淀粉粒变化；可溶性糖含量先升高后降低。花芽分化期无叶片，根系枯萎；鳞茎芽开始进行花芽分化；鳞片细胞内脐点完全消失，淀粉粒减少直至消失，可溶性糖含量在3.00％以上。
　　2.温度对中国水仙芽休眠的影响分析。
　　根据2011、2012年漳州地区气温的日变化分析，结合中国水仙鳞茎芽解剖学研究表明：温度是中国水仙鳞茎芽休眠发生的环境因子。候平均气温达到25℃以上，中国水仙鳞茎芽进入休眠状态；有效积温（T≥25℃）5-150℃范围时，中国水仙鳞茎芽处于休眠状态；有效积温达到150℃左右时，中国水仙鳞茎芽解除休眠，开始进入花芽分化阶段。
　　3.中国水仙转录组数据库的构建与分析。
　　以鳞茎膨大期、休眠 I期、休眠 II期、休眠III期和花芽分化期5个时期的中国水仙3年生鳞茎为材料，构建中国水仙转录组数据库。通过Illumium测序共获得142,866条 All-unigene；通过 BLASTx和BLASTn比对方法（E value<10-5）以及生物信息学分析表明，共有70,313条All-unigene在NR、NT、COG、Swiss-Prot、KEGG5个数据库能进行功能注释，每库注释比例分别为93.98%、66.08%、33.43%、59.11%、55.50%。根据FDR≤0.001且∣log2Ratio∣≥l原则，共筛选得到与温度有关且在5个时期两两对比中均差异表达的基因18个，包括磷酸丙糖异构酶基因、温度诱导植物脂质运载蛋白基因等；并获得注释为FT同源基因的序列19个，其中有6个注释序列呈差异表达。
　　4.中国水仙休眠相关基因的获得与生物信息学分析。
　　在中国水仙转录组数据库分析的基础上，采用RT-PCR或RACE技术分离得到8个中国水仙休眠相关基因即4个FT（Floweringlocus T）同源基因NtFT1、NtFT2、NtFT3、NtFT4，1个TIL（temperature-induced lipocalin）同源基因NtTIL，1个TIM（Triosephosphate isomerase）同源基因NtTIM，2个COBRA同源基因NtCOB1、NtCOB2，结合生物信息学分析结果表明：（1）4个NtFTs基因均属于PEBPs基因家族，其中 NtFT1含174个氨基酸，为稳定的酸性蛋白，无跨膜结构；NtFT2含176个氨基酸，为不稳定的中性蛋白，无跨膜结构；NtFT3含181个氨基酸，为稳定的碱性蛋白，含有1个跨膜结构；NtFT4仅获得256bp。（2）NtTIL属于lipocalin-2基因家族，编码188个氨基酸，是稳定的酸性亲水蛋白，含有1个跨膜结构。（3）NtTIM属于Triosephosphate phosphate-binding protein基因家族，编码254个氨基酸，是稳定的酸性疏水蛋白，含有1个跨膜结构。（4）NtCOB1、NtCOB2均属于COBRA基因家族，均编码451氨基酸，是稳定的亲水碱性蛋白，含有信号肽，其中NtCOB1含有2个跨膜结构，NtCOB2含有3个跨膜结构。
　　5.中国水仙芽休眠相关基因的表达分析。
　　通过qRT-PCR法，分析已获得的8个中国水仙芽休眠相关基因在鳞茎膨大期、休眠期、花芽分化期3个时期内的表达变化，结果表明：（1）鳞茎膨大期，除NtFT1表达量上升外，其余3个成员的表达量均下降；休眠期内，NtFT1表达量呈“W”变化，与其余3个成员的表达量变化相反；花芽分化期，NtFT3表达量高于其余3个成员的表达量。（2）NtTIL在鳞茎膨大期表达量上升；休眠期随着环境温度逐渐增加，NtTIL表达量先升高后下降；花芽分化期表达量升高。（3）NtTIM在鳞茎膨大期表达量逐渐增加；休眠期间，表达量先下降再升高；花芽分化期表达量显著地上升。（4）NtCOB1、NtCOB2在鳞茎膨大期表达量逐渐升高；休眠期，NtCOB1表达量呈“W”变化，与NtCOB2表达量变化相反；花芽分化期2个基因的表达量均处于较低水平。
　　8个中国水仙休眠相关基因对中国水仙休眠的调控作用表现为：在外界温度发生改变时（T≥25℃），NtCOBs作为温度响应因子，接收温度信号途径的刺激，并进行跨膜传递，引起细胞内NtTIL表达改变，NtTIL具有积温效应并能将积温效果进行传递，同时，NtTIM亦表现变化，最终温度信号途径的目标基因NtFTs表达发生变化。NtFTs基因是中国水仙休眠诱导与解除的决定基因，其中NtFT1诱导中国水仙休眠后期发生，NtFT2诱导中国水仙花芽分化，NtFT3诱导与解除中国水仙芽休眠并启动花芽分化，NtFT4诱导并维持中国水仙芽休眠。总之，中国水仙休眠是外界温度发生改变时，启动相关基因（ NtTIM、NtTIL、NtCOBs）转录水平的变化，共同参与调控物质代谢、能量代谢、温度信号转导等生理生化过程，并通过改变目标基因NtFTs的表达，最终实现对中国水仙休眠的调控。
　　6.中国水仙愈伤组织再生体系的建立及组织形态学观察。
　　以中国水仙子房为材料诱导愈伤组织，并对其进行受体系统优化和细胞组织学观察，结果表明：在MN+4.0 mg/L6-BA+0.4 mg/L2,4-D+0.2 mg/L NAA中愈伤组织诱导率最高，达到66.27%；在MN+2.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L2,4-D+30 g/L白糖上培养60d，愈伤组织繁殖系数最佳，达到5.16倍，能长期保持愈伤组织特性；在MN+4.0 mg/L6-BA+0.4 mg/LNAA分化培养基中愈伤组织的分化率达到94.17%；在1/2MS+0.2 mg/L NAA生根培养基中小鳞茎根系粗壮且发达；25.0 mg/L潮霉素能够有效地抑制愈伤组织的生长并使其致死；小鳞茎再生过程可分为启动期、分裂期、分化期、形成期4个时期，启动期形成米白色瘤状突起愈伤组织，细胞质稀薄，细胞壁脆弱；分裂期形成米白色颗粒状愈伤组织，细胞质浓而密，细胞排列致密；分化期形成白色团状组织，细胞质浅，细胞大，导管形成；形成期是小鳞茎由白色团状组织着生而来。
　　7.根癌农杆菌介导中国水仙休眠相关基因转化体系的确立。构建了中国水仙休眠相关基因（NtFT2、NtTIM、NtTIL）的正义表达载体p1301-NtFT2、p1301-NtTIM和p1301-NtTIL，并通过液氮冻融法分别将正义表达载体 p1301-NtFT2、p1301-NtTIM和p1301-NtTIL导入农杆菌LBA4404中，获得3个植物表达载体。以含p1301-NtFT2的根癌农杆菌侵染中国水仙愈伤组织受体，结果表明：中国水仙愈伤组织切割后置于0.5 mol/L甘露醇处理6 h，浸泡于OD1.0的农杆菌重悬液中侵染20 min，于25℃、黑暗条件下共培养6 d，其GUS瞬时表达率达到64.28%。共培养后采用300 mg/L头孢霉素进行除菌20 min，并转接于MN+2.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L2,4-D+100 mg/L Cef.进行恢复培养数天，再进行筛选。此转化体系的确立将为下一步开展中国水仙休眠相关基因功能验证及培育新品种奠定基础。
　　本研究为解决高温对中国水仙休眠的影响及植物夏休眠机理提供依据和借鉴，并为培育中国水仙越夏新品种提供新的思路和途径。

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第一章 引言

1. 植物芽休眠调控机理研究进展

2 中国水仙研究进展

3 转录组测序技术的应用

4 本研究的内容和意义

第二章 中国水仙休眠期解剖学及可溶性糖含量研究

第一节 中国水仙休眠期解剖学研究

第二节 中国水仙休眠期可溶性糖含量的测定

第三节 温度对中国水仙芽休眠的影响

第三章 中国水仙转录组测序分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 中国水仙芽休眠相关基因的克隆与表达分析

第一节 中国水仙NtFTs基因家族的克隆与生物信息学分析

第二节 中国水仙NtTIL的克隆与生物信息学分析

第三节 中国水仙NtTIM的克隆与生物信息学分析

第四节 中国水仙Nt COBs基因家族的克隆与生物信息学分析

第五节 中国水仙芽休眠相关基因的表达分析

第五章 根癌农杆菌介导休眠相关基因转化中国水仙的初步研究

第一节 中国水仙愈伤组织再生体系的建立

第二节 中国水仙愈伤组织受体系统的建立及细胞组织学观察

第三节 中国水仙芽休眠相关基因正义表达载体的构建

第四节 中国水仙遗传转化体系的建立

第六章 小结与展望

6.1 研究结论

6.2 研究的创新点

6.3 展望

参考文献

附录I 中国水仙休眠相关基因cDNA序列及推导的氨基酸序列

附录II 中国水仙休眠相关基因限制性酶切位点分析

附录III 图版及图版说明

致谢