H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

摘要

禽流感是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）感染禽类后引起的一种疾病综合征，包括呼吸道、消化道、产蛋量下降或免疫抑制等疾病，可分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感三类。虽然H9N2亚型禽流感病毒属于低致病性禽流感，但疫病在我国广泛流行，且还发生了多起感染人的事件。由于H9N2禽流感病毒具有频繁变异与重组的特性，不仅给养殖业造成了巨大的损失，同时也严重威胁着人类的生命安全。预防和控制禽流感最有效的手段就是接种疫苗，目前国内比较常见的用来制备H9N2亚型禽流感的疫苗株主要是A/Chicken/Shanghai/F/98（F株）与A/Chicken/Shanghai/6/96等。这些毒株均是08年之前分离的，与现在流行株的抗原性差异非常大，因而疫苗急需升级换代。
　　本试验从2013年在浙江、安徽、安徽等地活禽市场所采样品中分离获得8个H9 AIV分离株。这些H9N2禽流感毒株通过10倍稀释，分别经接种鸡胚尿囊腔接种，最后取尿囊液血凝效价最高的进行下一轮的纯化。三次纯化后，收集最高稀释度和血凝效价的鸡胚尿囊液，存放于-80度冰箱。
　　通过鸡胚尿囊RNA的提取后，经过反转录、PCR等获得所需要的目的基因片段(其中PB2、PB1、PA、HA、NP基因分成两段扩增)。PCR产物割胶回收并纯化，并送上海美吉公司进行测序。序列测定完成后用DNAstar软件中的SeqMan程序进行序列拼接、用MegAlign程序对拼接后的序列序列进行同源性分析。并用Mega6软件绘制进化树，分析不同年份、不同地域的H9N2亚型AIV流行毒株的遗传进化。
　　结果表明：这8株分离株它们之间的HA基因的同源性为95.7-100％，氨基酸的同源性为96.4-99.8%，NA的核苷酸同源性在93.7%-99.8%之间，氨基酸的的同源性为93.1%-99.8%，NS的核苷酸同源性为95.3%-100%，M的核苷酸同源性为98.2%-100%、NP的核苷酸同源性为95.3%-100%、PA的核苷酸同源性为97.2%-100%、PB1的核苷酸同源性为96.1%-100%、PB2的核苷酸同源性为96.1%-100%。遗传进化分析结果表明，这8株H9N2亚型禽流感病毒株的HA、NA、NS、M、NP、PA、PB1、PB2基因均属于同一亚系分支，具有较高的同一性。但这些H9N2 AIV与之前的疫苗毒(F株)的HA基因的遗传关系较远，不在同一分支上。
　　结论：现在的H9N2 AIV流行株在抗原性方面较为一致，但与过去毒株的抗原性相差甚远；这些H9N2 AIV流行株的获得，为新的H9 AIV疫苗研制奠定了毒株的基础。

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第一章 文献综述

1 禽流感概述

2 禽流感重要历史事件

3禽流感的病原学特征

3.1形态结构及生物学特性

3.2禽流感的遗传变异特性

4流感病毒致病机制

4.1血凝素（HA）与流感病毒致病性的关系

4.2 神经氨酸酶（NA）与流感病毒致病性的关系

4.3聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）与流感病毒致病性的关系

4.4核蛋白（NP）与流感病毒致病性的关系

4.5基质蛋白（M）与流感病毒致病性的关系

4.6非结构蛋白（NS）与流感病毒致病性的关系

5 禽流感疫苗研究

5.1全病毒灭活疫苗

5.2亚单位疫苗

5.3基因重组活载体疫苗

5.4 DNA疫苗

5.5病毒样颗粒疫苗

5.6冷适应流感弱毒疫苗

5.7表位疫苗

6 H9N2禽流感病毒的危害

6.1 H9N2禽流感养殖业的危害

6.2 H9N2禽流感对人类的潜在危害

7 研究的目的与意义

第二章 H9亚型禽流感病毒全基因组的序列分析

1 试验材料

1.1材料

1.2主要试剂

1.3实验仪器设备和器材

1.4 3.8%柠檬酸钠的配制

1.5 0.5%鸡红细胞悬液制备

1.6 LB 培养基配制

1.7引物序列设计

2 试验方法

2.1 病毒分离鉴定及纯化

2.2 病毒的血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验

2.3病毒的纯化

2.4病毒全基因组测序

2.5 病毒全基因组序列分析及遗传进化分析

3 结果与分析

3.1 病毒分离结果

3.2 病毒纯化结果

3.3 H9 亚型 AIV 全基因组片段扩增结果

3.4 HA基因的测序相关结果及遗传进化分析

3.5 NA基因的测序相关结果及遗传进化分析

3.6 NS基因的测序相关结果及遗传进化分析

3.7 M基因的测序相关结果及遗传进化分析

3.8 NP基因的测序相关结果及遗传进化分析

3.9 PA基因的测序相关结果及遗传进化分析

3.10 PB1基因的测序相关结果及遗传进化分析

3.11 PB2基因的测序相关结果及遗传进化分析

4讨论

4.1 8株H9N2分离株HA 序列分析讨论

4.2 8株H9N2分离株NA 序列分析讨论

4.3 8株H9N2分离株8个基因片段同源性和遗传进化分析讨论

第三章 结论

1.结论

2.本研究创新点

3.尚需进一步深入研究的问题

参考文献

致谢