基于线粒体COI基因蚊类库蚊DNA条形码技术研究

摘要

库蚊属（Culex）隶属于昆虫纲(Insecta)、双翅目(Diptera)、蚊科(Culicidae)、库蚊亚科(Culicinae)，其分布广泛。目前为止，我国已报道该属9亚属计82种，其中很多种类均是重要媒介昆虫。为了能更好地掌握和防治蚊媒传染病，准确鉴定媒介蚊类蚊种是很有必要的。目前，形态特征鉴定是常用的经典方法，但因媒介蚊类鉴定特征细微，容易受形态完整性影响，形态学分类方法有时候存在某方面的局限性，另外在近缘种的鉴定上对于专业积累的要求更为苛刻。因此急需一种快速、精确、可自动化的以及全球通用的分类鉴定工具。线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基( mtDNA COI)基因是目前基因库中数据最多的片段，结构与进化动力学研究比较清楚的基因之一，其结构相对保守，种间变异较大，能够提供丰富的系统发育信息。基于线粒体COI基因的DNA条形码技术可以快速完成物种的鉴定。
　　本研究从已经过形态学鉴定的库蚊属成蚊标本中选取22种蚊，依据采集情况每种1-8只个体，共73只蚊虫进行其线粒体DNA基因组的提取，并对mtDNA COI基因进行序列扩增、克隆和测序。通过Blast分析，获得73条COI序列，并对序列特征进行分析。经过分子分类鉴定和类群推测后，从中选出其中的22条有特异性差异的序列，并结合GenBank中库蚊属已有的16种蚊虫的COI序列，以Chironomus nepeanensis为外群，应用MEGA5.1软件，对38条COI序列系统发生树的构建。系统发生树的重建釆用NJ法，并依据重建的NJ树分析中国库蚊属蚊虫间的分类地位和系统发生关系。以mtDNA COI基因作为DNA条形码的编码基因，探讨其作为库蚊属蚊虫鉴定的可行性。
　　本研究得到以下结果：
　　（1）mtDNA COI基因在碱基组成、密码子使用和氨基酸组成具有一定的偏向性。
　　（2）100％蚊虫COI基因的种内距离均小于2%，除部分蚊种外，蚊虫种间距离大于2%。
　　（3）COI分子数据提示：库蚊属中凶小库蚊可能存在隐藏种。库蚊属中的包蚊亚属蚊种凶小库蚊被聚类于库蚊亚属内。小斑翅库蚊和类斑翅库蚊可能是东方库蚊的同物异名。
　　（4）依据mtDNA COI基因的分子标记数据，对已经进行形态鉴定的库蚊属蚊虫进行分子鉴定，通过序列差异分析与亲缘关系的分析，73只形态鉴定的成蚊和分子鉴定的结果基本一致。
　　（5）基于mtDNA COI基因序列重建了我国库蚊属38个种类的系统发生树。支序树分析结果显示：8亚属均能较好区分出，库蚊亚属中尖音库蚊系与海滨库蚊系聚为一支，除包蚊亚属、新库蚊亚属均只有一种，其他亚属各种均能很好聚合在一起，呈现很好的单系性。真黑蚊亚属中的冲绳库蚊不能很好地与该亚属内其他蚊种聚合在一起，但仍能与该亚属其他蚊虫聚在一起。新库蚊亚属中的惊骇库蚊单独分为一支，其原因可能是由于种团内其他成员较少所致，因此其进化地位仍需进行进一步的研究。

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第一章 前言

1.1绪论

1.2库蚊属研究概况

1.3线粒体基因组及COI基因在分子系统学中的应用

1.4 DNA条形码技术

1.5本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

1材料

2方法

第三章 结果与分析

1形态分类研究

2 蚊虫总DNA提取、目的片段扩增及其产物回收测定

3 pGM-T重组菌落PCR鉴定结果

4 COI基因序列分析

5 COI作为条形码基因分析

6分子系统树分析

第四章 讨论

1 形态分类研究讨论

2 分子分类研究讨论

3 DNA条形码研究讨论

4 系统发生研究讨论

第五章 总结

参考文献

致谢