真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生物碱含量影响及其机理

摘要

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是兰科石斛属多年生附生草本植物，是一种兼具观赏价值与药用价值的中草药。本文选用铁皮石斛原球茎为材料（产地为福建连城），对原球茎离体培养条件进行优化，并以此为基础测定不同浓度和处理时间尖孢镰刀菌诱导子处理下铁皮石斛原球茎总生物碱含量的变化。同时克隆了两个调控生物碱合成途径相关酶的基因——DoHDR基因和DoIspF基因，并进行了基因相对表达量分析。
　　1.铁皮石斛离体培养条件优化
　　以连城铁皮石斛为材料，优化铁皮石斛离体培养条件。①对比水杨酸、蛋白胨和番茄汁对铁皮石斛原球茎增殖的影响，结果显示，当水杨酸浓度为2 mg/L时原球茎增殖效果最好，但原球茎生长状态不好。蛋白胨浓度为2 mg/L时最有利原球茎增殖，番茄汁添加量为100 ml/L时原球茎增殖效果最好，且原球茎生长旺盛。②比较几组不同混合有机添加物对铁皮石斛原球茎增殖的影响，采用的添加物组合分别为香蕉和土豆、苹果和土豆、香蕉和苹果、番茄和土豆。结果表明添加50 g/L土豆增殖效果最好③比较不同容器和培养方式对原球茎增殖的影响，结果表明，采用三角瓶液体振荡培养最有利原球茎增殖。
　　2.真菌诱导子对铁皮石斛总生物碱含量的影响
　　基于优化的离体培养条件下所得到的大量原球茎，比较不同浓度不同处理时间尖孢镰刀菌诱导子对铁皮石斛总生物碱的影响，结果发现当诱导子浓度较低时（100 mg/L，200 mg/L），总生物碱含量随处理时间增加呈先上升后下降的趋势，当诱导子浓度较高时（500 mg/L），总生物碱含量先下降后上升，而当诱导子浓度过高时（1000 mg/L）总生物碱合成受到抑制，含量都比较低。而最适宜生物碱合成与积累的条件为200 mg/L诱导子处理3天，总生物碱含量最高。
　　3.铁皮石斛HDR基因和IspF基因的克隆和生物信息学分析
　　以铁皮石斛原球茎为材料采用同源克隆与 RACE相结合的方法，得到铁皮石斛 MEP途径的2个基因——DoHDR和DoIspF，DoHDR全长1784 bp，包含完整ORF，长度为1382 bp，编码460个氨基酸，生物信息学分析表明该基因编码的蛋白为稳定的酸性亲水蛋白，不具有跨膜结构，不含信号肽，二级结构预测表明，该蛋白主要含有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。该蛋白共有20个磷酸化位点，其中有7个丝氨酸(Ser)磷酸化位点，苏氨酸位点（Thr）7个，酪氨酸位点（Tyr）6个。该蛋白最有可能定位于内质网膜，属于lytB_ispH超家族，该蛋白与单子叶植物兰科蝴蝶兰亲缘关系最近。
　　本研究得到的另外一条基因DoIspF基因全长891 bp，含有完整ORF为785 bp，编码260个氨基酸，编码的蛋白为不稳定水溶性蛋白，不含跨膜结构不含信号肽，最有可能定位于叶绿体类囊体膜上，二级结构预测结果表明该蛋白含有较多无规则卷曲，以及较少的α-螺旋和β-折叠，IspF蛋白共有15个磷酸化位点，其中丝氨酸位点（Ser）9个，苏氨酸位点（Thr）5个，酪氨酸位点（Tyr）1个。蛋白质功能位点预测结果表明该蛋白属于MECDP合酶超家族，该蛋白与单子叶植物纲禾本科植物玉米亲缘关系最近。
　　4.真菌诱导子处理下生物碱合成相关基因DoHDR与DoIspF基因相对表达量分析
　　①尖孢镰刀菌诱导子处理下DoHDR基因相对表达量分析。当诱导子浓度偏低（100 mg/L）或者偏高（500 mg/L）时，HDR基因相对表达量变化趋势与未添加诱导子时一致，随着处理时间增长呈先上升后下降的趋势，峰值出现在处理5天时，当诱导子浓度为200 mg/L时，HDR基因仍然呈先上升后下降的趋势，但峰值出现在处理3天时，当诱导子浓度过大时（1000 mg/L），HDR基因表达受到抑制，与生物碱含量的趋势大致上相符，推测 HDR基因与生物碱含量呈正相关。②尖孢镰刀菌诱导子处理下DoIspF基因相对表达量分析。未添加诱导子时，DoIspF基因表达量随时间逐步上升，当诱导子浓度为100 mg/L、200 mg/L、500 mg/L时DoIspF基因相对表达量均为先上升后下降的趋势，当诱导子浓度为1000 mg/L时，基因表达量大致呈逐步下降趋势。