小菜蛾RNAi通路核心元件的基因组筛选及PxDcr­-2基因的功能验证

摘要

RNA干扰（RNA interference，RANi）是由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发，使得mRNA降解或翻译被抑制的现象，在真核生物中高度保守。根据生物学机制和所结合Argonaute（Ago）蛋白的不同，RNAi在生物体内存在三条通路：小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、小RNA（microRNA，miRNA）和PIWI互作RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）。虽然RNAi通路的核心元件在大多数生物中是保守的，但昆虫中它们的保守程度却不尽相同。而小菜蛾是目前全球分布的重要十字花科害虫，在虫体中能够实现RNAi。因此，我们利用小菜蛾基因组和转录组数据，依据秀丽隐杆线虫、果蝇、赤拟谷盗和家蚕的相关信息，筛选出RNAi通路中的核心元件。本研究中，在小菜蛾中发现2个Dicer基因、1个Drosha、基因5个Argonaute基因、1个Pasha基因和1个Loquacious基因，但并没有发现R2D2基因。并且对这些基因在小菜蛾中不同发育阶段和组织中的表达模式通过qPCR进行了分析。
　　作为RNAi通路中的核心元件，Dicer-1蛋白主要在miRNA通路中发挥作用，Dicer-2蛋白则是siRNA形成中至关重要的。本研究中，对小菜蛾Dicer-1（PxDcr-1）基因CDS的全长和小菜蛾Dicer-2（PxDcr-2）基因CDS的全长首次进行了克隆和分析，并且通过 RNAi实验对 PxDcr-2基因的功能进行了初步探索。PxDcr-1基因的CDS全长为8457 bp，氨基酸序列长度为2818 aa；PxDcr-2基因的CDS全长为5,091 bp，氨基酸序列长度为1,696 aa。通过氨基酸序列比对和进化树分析，PxDcr-1和PxDcr-2蛋白都与鳞翅目昆虫同源性最高，特别是黑脉金斑蝶。在RNAi干扰的实验中，dsDcr-2-2对PxDcr-2的mRNA表达量的抑制效果最佳，但在注射dsRNA后，在生长发育过程中没有明显的表型变化。为了研究PxDcr-2在小菜蛾siRNA通路中的作用，将dsDcr-2-2和dsBursα/dsCYP同时向虫体注射，发现小菜蛾蛹的畸形率和死亡率与单独注射 dsBursα/dsCYP相比，有所下降，说明 PxDcr-2在小菜蛾 RNAi通路中发挥了作用。

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1 前言

1.1 昆虫中的 RNAi通路类型

1.1.1 siRNA通路

1.1.2 miRNA通路

1.1.3 piRNA通路

1.2 Dicer蛋白的研究概况

1.2.1 Dicer蛋白的生化特征及作用方式

1.2.2 Dicer蛋白的研究进展

1.3 小菜蛾体内的 RNAi研究进展

1.3.1 小菜蛾简介

1.3.2 小菜蛾中的 RNAi研究进展

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试昆虫

2.1.2 主要试剂

2.1.3 供试菌种

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 基因的筛选

2.2.2 序列分析

2.2.3 氨基酸序列比对及进化树构建

2.2.4 小菜蛾 RNA的提取

2.2.5 cDNA的合成

2.2.6 PCR验证基因

2.2.7 qPCR基因表达量测定

2.2.8 dsRNA的合成

2.2.9 dsRNA的注射

2.2.10 数据统计与分析

3 结果与分析

3.1 小菜蛾 RNAi通路元件分析

3.1.1 小菜蛾 RNAi通路元件的特征

3.1.2 小菜蛾 RNAi通路元件蛋白结构域及同源性

3.1.3 小菜蛾 RNAi通路核心元件的表达模式分析

3.2 小菜蛾中 Dicer基因的特征与功能验证

3.2.1 PxDcr-1和 PxDcr-2的氨基酸序列比对与进化树分析

3.2.2 PxDcr-1和 PxDcr-2的保守域

3.2.3 PxDcr-1和 PxDcr-2的三维结构

3.2.4 PxDcr-2的 RNAi

3.2.5 PxDcr-2对小菜蛾体内 RNAi通路的影响

4 讨论

4.1 小菜蛾中的 RNAi通路

4.2 小菜蛾中 RNAi通路核心元件表达模式

4.3 PxDcr-2在 RNAi通路中能够发挥作用

参考文献

附录 1

附录 2

附录 3

致谢