福州温泉嗜热菌多样性及嗜热菌Geobacillus thermoglucosidasius低温适应的机制

摘要

温泉是地球上一类重要的热环境，其高温和贫营养环境中生存着大量的嗜热微生物。嗜热菌是一类重要的微生物，在生存机制和应用方面都吸引着越来越多关注。地球上不同地区温泉嗜热菌组成差异很大，对不同地区温泉中嗜热菌多样性研究有利于加深对该类生态系统的认识。地芽孢杆菌属（Geobacillus）是温泉可培养嗜热菌中的优势菌，也是堆肥等热环境中的常见菌种，但是随着近年来在常温和寒冷环境中不断分离到Geobacillus属菌株，这类嗜热菌适应低温生存的机制引起人们关注。本论文通过调查福州三处温泉的嗜热菌多样性，发现Geobacillus属细菌在温泉热环境中广泛分布，在此基础上进一步研究了Geobacillus属细菌的低温适应机制。
　　本研究应用Illumina MiSeq平台检测福州大汤（DaTang)、汤埕(TangCheng)和双龙(ShuangLong)三处温泉水体中的细菌16S rDNA多样性，显示三处温泉中嗜热菌多样性丰富，其中丰度较大的嗜热菌有变形菌门（ Proteobacteria），厚壁菌门（Firmicutes），产水菌门(Aquificae)，硝化螺旋菌门（Nitrospirae），装甲菌门（Armatimonadetes），栖热菌门（Thermi），GAL15菌门，酸杆菌门（Acidobacteria），绿菌门（Chlorobi），放线菌门（Actinobacteria），绿弯菌纲（Chloroflexi），OP1菌门，OD1菌门，拟杆菌门（Bacteroidetes）和EM3菌门。不同温泉之间细菌多样性差异较大，Pearson相关性分析和RDA分析显示三处温泉微生物多样性的差异与温泉温度、Na+、NO2-和Mg2+等水体理化性质有关。对福州地区三个典型温泉：大汤温泉、汤埕温泉和双龙温泉温泉底泥中的可培养嗜热菌进行了研究，结果显示大汤温泉嗜热菌的种类多于汤埕，双龙温泉嗜热菌最少。进一步分析发现三个温泉嗜热菌多样性与pH，碱解氮和有效磷有关，pH越低，碱解氮和有效磷含量越高温泉中嗜热菌越丰富。所分离的32株嗜热菌隶属于6个不同的属，其中Geobacillus属和Anoxybacillus属菌株为福州温泉中的优势嗜热菌菌种。可培养方式和非可培养方式研究对比发现温泉中可培养菌只占非常小一部分，坚壁菌门中产芽孢细菌较易培养；栖热菌，变形菌等嗜热菌没有从现有的培养方式中得到纯培养物。改善可培养方式或者应用宏基因组学手段有利于进一步挖掘温泉嗜热菌基因资源。对分离的一株嗜热菌Geobacillus sp. CHB1进行了鉴定和基因组测序。该菌生长温度范围为47oC~74oC之间，最适生长温度为60oC。16S rDNA测序发现该菌与标准菌株Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T同源性最近为99.26％。该菌的G+C含量为49%，与Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T基因组杂交率为75%。但是其与标准菌株Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T在生理生化特征和细胞膜磷脂脂肪酸组成方面又有所不同，判断该菌株为 Geobacillus thermoglucosidasius种的一个亚种。对Geobacillus sp. CHB1基因组进行测序，该菌株基因组长度为3.22M，编码4122个开放阅读框。
　　本研究以Geobacillus sp. CHB1为目标菌株，应用适应性进化技术（Experimental evolution）向低于其最低生长温度的方向进化，经过6个月的实验得到了可以在43oC温度下起始生长的进化菌株。进化菌株生长速度明显高于初始菌株。进化菌株Ec细胞膜磷脂脂肪酸在低温下表现出剧烈调整的倾向，iso15:00在45oC低温生长时相对含量显著上升，这也从另一个方面证明了进化后的菌株对低温的适应能力更好。比较蛋白组学发现进化菌株与核苷酸相关的蛋白表达量上调，而与脂肪酸代谢相关的蛋白表现下调。蛋白组学结果与进化菌株表现出较高的生长速度和较强的脂肪酸调节能力是相一致的。在前期6个月进化的基础上，以Ec为出发菌株又继续向更低生长温度进行了12个月的进化实验。温度生长实验证明，液体培养条件下三个进化群体（F1、F2和F3)都可以在38-39oC之间稳定生长传代，固体平板实验证明进化群体中挑取的菌株F3可以在39oC温度条件下生长并形成菌落。这些证明，在Ec的基础上，经过12个月的进化实验，该菌的最低生长温度又下降了至少4oC。对进化群体Ec，F2和F3进行重测序分析，发现两个群体有15个共有的突变基因，其中7个基因在两个群体中突变位置不同，说明这些基因很可能在这个阶段适应低温的过程中起到重要的作用。比较基因组学发现MFS、DNA聚合酶β亚基、AB水解酶和肽酶等是独立适应低温进化的群体共有的突变基因，认为这些基因是与低温适应有关的潜在基因突变。从F3群体中挑取两个单菌落重测序，发现个体基因组中杂合子明显少于其对应的群体F3，说明在适应低温进化过程中群体内菌株间积累了大量的不同的突变，这些突变有些还没有在群体中固定下来。在这个阶段Ec适应更低温度的进化过程中还出现了一些突变体，F3群体中出现了细胞分裂被抑制的长线形菌体，通过比较基因组结果发现该群体中FtsK基因发生了倒位突变。这些结果加深了对嗜热菌适应低温的机制的理解。过氧化氢酶在独立进化的群体EA、EB和EC均表现出比初始菌株A高出20倍以上的过氧化氢酶活性。质谱鉴定证明起作用的过氧化氢酶是一种携带血红素的单功能过氧化氢酶，针对该基因的qPCR进一步证明其在进化菌株中高表达。进化菌株的发酵液和重组过氧化氢酶都显示出该过氧化氢酶在0℃~40℃温度范围内至少有40%以上的活性，表明该酶在Geobacillus低温生长时是以活性形式存在的。有研究表明过氧化氢酶可以促进一些常温菌在低温下的生存能力。我们认为适应性进化过程中群体中过氧化氢酶高表达个体的出现是一个重要事件，该过氧化氢酶高表达个体更能适应该个体出现时的低温环境，随着该适应低温个体在群体中占据统治地位出现了整个群体对低温适应性增强的现象。

目录

声明

第1章 引言

1.1嗜热菌多样性研究现状

1.2 嗜热菌温度适应机制的研究方法与人工进化技术

1.3 Geobacillus 属研究进展

1.4 本研究的内容和意义

第2章 福州温泉细菌多样性

2.1 材料和方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第3章 嗜热菌Geobacillus sp. CHB1的低温适应机制

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第4章 过氧化氢酶与低温适应性

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4小结

总结与展望

一、总结

二、本文主要创新点

三、展望

参考文献

附录

致谢