基于转录组测序的杉木磷转运相关基因的鉴定及表达分析

摘要

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国特有的针叶速生用材树种，其生长发育受营养元素磷的影响较大。由于南方酸性土壤对磷的强烈化学固定作用，导致土壤有效磷极度缺乏，杉木生长受到抑制。长期以来多代连栽的培育方式又加剧了杉木林地土壤磷营养的缺乏，因此研究筛选磷高利用效杉木良种显得十分迫切。虽然近年来对磷高效利用杉木进行了大量的研究，取得了一些研究成果，但目前的研究大多集中在杉木木根系构型、胁迫生理响应、土壤肥力维持及林分营养循环等方面，主要是通过杉木生理生化过程的测定来进行研究的。由于受全基因组和转录组等序列信息的限制，目前仍缺乏对杉木磷高效利用的分子机制方面的研究，特别是对杉木磷转运蛋白基因的克隆和功能研究报道极少，对杉木感受、吸收和转运土壤磷并调控其体内磷素分配的分子机制还不清楚。植物对土壤无机磷的吸收是主要依赖于Pht磷转运蛋白基因来实现的，探讨杉木磷转运蛋白关键基因的结构和功能，揭示杉木磷素营养吸收和转运的分子机制，对于选育磷高利用效杉木良种和提高杉木对土壤磷素的利用效率具有重要的现实意义。本文选用导师课题组前期研究筛选出的磷高效利用的4、25、32号杉木无性系为试验材料，利用RACE和荧光定量PCR技术对杉木高亲和磷转运基因ClPht1;1进行了全长克隆、亚细胞定位和低磷胁迫下的时空表达分析；使用转录组测序技术建立了32号杉木无性系根、茎、叶转录组数据库，并对转录组中的磷转运相关基因进行了筛选和功能注释；对注释的2个杉木磷转运相关基因c200084_g1和c221441_g1进行了全长克隆和低磷胁迫下的时空表达分析。
　　本研究主要内容包括：⑴使用RACE技术克隆获得一个杉木磷转运蛋白Pht1基因，命名为ClPht1;1（GenBank登录号：KX302006）。基因序列编码区长1967bp，编码545aa的蛋白质，其原子组成为C2750H4198N698O751S28，分子量为59.95kDa，等电点为9.04，不稳定系数为33.44，为稳定蛋白；脂肪系数为82.57，总平均亲水性0.226，判断为疏水性蛋白。ClPht1;1所编码蛋白具有Pht1基因家族的典型结构，与日本柳杉等磷转运蛋白基因具有高度同源性。亚细胞定位存在于细胞质中，在高尔基体、内质网上有点状分布，可以排除在细胞核、细胞膜和叶绿体上的可能性。⑵ClPht1;1基因与PHT1家族基因表达特征相同，主要在杉木的根部表达，在叶片中的表达量较低；在不同磷利用效率的杉木家系中表达量存在较大差异，同时ClPht1;1基因的表达受低磷胁迫的诱导，缺磷胁迫下ClPht1;1基因表达量明显升高，恢复供磷后ClPht1;1基因表达量明显降低，且胁迫程度越高，表达变化越显著。⑶通过对转录组测序数据过滤去杂，从杉木根、茎、叶序列中分别获得76,829,210个、82,165,990个及77,534,078个Clean reads，重新组装拼接后共获得413,806个Unigenes，平均长度为520bp。共有109,596个杉木Unigenes在NR数据库中被注释，75.0％的映射序列具有很强的同源性，17.8%的Unigenes具有超过80%的相似性；基于物种分布分析，杉木Unigenes与高裸子植物北美云杉和无油樟的序列分别有7.5%和2.9%的匹配度。共有148,466个Unigenes在GO数据库中被注释，其中727,287个预测基因至少有一个GO功能注释信息；共有92,001个Unigenes在KOG数据库中具有具体的蛋白功能定义；共有57,042个Unigenes在KEGG数据库中存在有意义的匹配，同时存在132个KEGG代谢通路。通过Unigene数据库的基因功能注释，共有49个基因被确认具有无机磷酸盐转运功能，其中25个基因被注释为参与无机磷酸盐跨膜转运活动。⑷对杉木c200084_g1和c221441_g1两条基因进行克隆分别得到1634bp和1753bp的全长序列，由386和487个氨基酸组成。蛋白理化性质显示两个基因编码蛋白分子量分别为43.49kDa和53.06 kDa，等电点分别为5.60和5.27，c200084_g1为不稳定、亲水性蛋白， c221441_g1为稳定、亲水性蛋白，两个基因编码蛋白均没有信号肽，都不是分泌型蛋白。c200084_g1基因编码蛋白有一个跨膜区域，二级结构中无规则卷曲Loop环所占比例最多为50.26%，c221441_g1编码蛋白有两个跨膜区域，二级结构中α-螺旋占比最大为49.9%。杉木c200084_g1基因BLAST结果显示与其他植物基因同源性大多在80%以上，编码蛋白序列比对一致性为90.96%。c221441_g1基因BLAST结果同源性较低，大多在40%左右，序列比对有66.33%的一致性。⑸c200084_g1基因在杉木根系表达量比较高，不同家系间根茎叶中表达量相差不大，同时其表达不受低磷胁迫诱导。c221441_g1基因在根中的表达量要远高于茎和叶，随着不同家系杉木磷利用效率的增强表达量升高，且该基因受低磷诱导表达。我们推测c200084_g1和c221441_g1可能参与植物体内有机磷化合物的代谢活动， c200084_g1基因可能具有部分植物细胞壁中有机磷的携带和转运功能，c221441_g1基因可能在植物体内脱磷酸化作用过程中具有有机磷的转运功能，具体的功能还需要进一步的挖掘研究。

目录

声明

前言

1 国内外研究进展

1.1 杉木磷营养研究进展

1.1.1磷营养缺乏对杉木人工林生长的影响

1.1.2 杉木适应低磷环境的机制研究

1.2 植物磷吸收及转运分子机制研究

1.2.1 植物对低磷胁迫的分子响应机制

1.2.2 植物高亲和及低亲和磷转运系统

1.2.3 植物PHT蛋白家族基因

1.3 植物转录组测序研究

1.3.1 转录组测序发展

1.3.2 植物转录组测序进展

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验设计

2.2.1 前期培养试验

2.2.2 后期分子试验

2.3 测定方法

2.3.1 杉木PHT1基因克隆方法

2.3.2 杉木PHT1基因亚细胞定位方法

2.3.3 不同磷胁迫下杉木PHT1基因时空表达分析方法

2.3.4 杉木转录组序列测定及其特征分析方法

2.3.5 杉木磷转运相关基因鉴定及表达分析方法

3 结果与分析

3.1 杉木PHT1基因全长克隆、亚细胞定位及表达分析

3.1.1 杉木根系总RNA提取及检测

3.1.2 杉木PHT1基因全长克隆

3.1.3 杉木PHT1基因生物信息学分析

3.1.4 杉木PHT1基因亚细胞定位分析

3.1.5 不同磷胁迫杉木PHT1基因表达分析

3.2 转录组测序分析

3.2.1 测序数据过滤

3.2.2 转录组拼接

3.2.3 转录组功能注释及分类

3.2.4 杉木磷转运基因分析筛选

3.3 杉木磷转运相关基因鉴定及表达分析

3.3.1 基因全长序列克隆

3.3.2 编码蛋白理化性质分析

3.3.3 编码蛋白结构预测

3.3.4 氨基酸序列同源性与聚类分析

3.3.5杉木磷转运相关基因的时空表达分析

4 讨论

4.1 植物磷转运PHT1基因

4.2 植物转录组测序技术应用

4.3 植物磷转运相关基因的分子机制

5 结论

参考文献

在读期间发表学术论文

致谢