PPARγ对炎症状态下C57小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇外流的影响

摘要

动脉粥样硬化(AS)是许多临床心血管疾病的病理基础，是多因素参与、多基因调控的复杂病理过程。细胞内胆固醇平衡失调、胆固醇代谢障碍导致的泡沫细胞形成是AS最主要的病理特征。巨噬细胞作为泡沫细胞的来源细胞之一，其胆固醇逆转运(胆固醇外流)功能是维持细胞内胆固醇平衡及影响泡沫细胞形成的重要环节，这一过程受多个信号通路及转录因子调节。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptors gamma，PPARγ)属核受体超家族成员，作用非常广泛，除参与脂质代谢、糖代谢平衡外，还涉及脂肪细胞、单核/巨噬细胞等多种细胞的分化。 近年的研究显示：PPARγ及其配体对巨噬细胞胆固醇外流也有重要作用，Chawla等首次将PPARγ、LXRα及ABCA1三者有机的联系在一起，提出了胆固醇外流的PPARγ-LXRα-ABCA1途径，认为PPARγ及其配体能通过这一途径明显促进巨噬细胞胆固醇外流。除此之外，PPARγ还可以通过反式阻抑机制负性调控巨噬细胞炎性基因的表达，明显抑制炎性反应。有关PPARγ抗炎作用研究发现：PPARγ激动剂能明显抑制炎性刺激诱导单核/巨噬细胞产生促炎细胞因子(TNFα、IL-1、IL-6、NO)；PPARγ配体预处理野生型动物，能明显降低组织内促炎细胞因子的表达，减轻炎症局部和远隔部位的组织损伤，对多种实验性炎性疾病，如急性心肌炎、自身免疫性脑脊髓炎、多发性硬化等均显示较好的治疗作用。 目前的研究已将动脉粥样硬化归结为脂代谢紊乱及慢性炎性损害综合作用的结果。因而在促进AS形成的重要因素炎症环境下，弄清PPARγ扮演何种角色以及对巨噬细胞胆固醇外流究竟产生何种影响和影响程度是非常有意义的，将有助于进一步揭示泡沫细胞的成因并对防治动脉粥样硬化开拓新的思路。基于此，本研究将PPARγ视作巨噬细胞调控胆固醇外流与炎症信号转导之间的“交汇点”，从体内和体外两个层面来观察炎症对C57小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇外流的影响并探讨PPARe在其中的作用。首先建立包括高脂，急性炎症等不同病理状态的C57小鼠模型并分离培养其腹腔巨噬细胞，观察细胞PPARγ，IкB-α表达变化，明确各组细胞胆固醇外流变化规律；然后采用PPARγ激动剂ciglitazone和PPARγ反义寡核苷酸预处理正常C57小鼠腹腔巨噬细胞，体外观察内毒素刺激对细胞胆固醇外流的影响，初步探讨炎症条件下C57小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇外流的变化以及PPARγ在维持巨噬细胞胆固醇外流与抗炎反应动态平衡中的作用。 主要结果如下： 1．高脂饮食组小鼠血脂水平(总胆固醇、总甘油三酯，4.17±0.68、3.47±0.59)明显高于正常饮食组(1.71±0.33、1.21±0.29，P<0.05)，两种饮食小鼠分别用内毒素刺激后血脂水平无明显差异(P>0.05)；正常及高脂饮食组小鼠经LPS刺激后血浆TNFα水平(7.09±1.95、6.64±1.39)较正常饮食组(2.09±0.37，P<0.01)显著升高，高脂饮食组(3.89±0.57)较正常饮食组(2.09±0.37，P<0.05)升高。 2．油红O染色可见两组高脂饮食小鼠腹腔巨噬细胞内脂滴增加；免疫细胞化学结果显示：正常及高脂饮食组细胞PPARγ无表达，LPS刺激后两组细胞表达均轻度升高；正常饮食组NF-кB无表达，高脂饮食组轻度升高，LPS刺激后两组细胞表达均明显增强。 3．Western-blotting检测结果显示：高脂饮食组和两个LPS组PPARγ蛋白表达(OD值分别为1.97±0.31、3.19±1.21、3.27±0.88)较正常对照组(1.00，P<0.05)均明显增高；高脂饮食组IкB-α表达(OD值0.88±0.19)较正常组(1.00，P>0.05)轻度降低，两种饮食经LPS刺激后IкB-α表达(OD值分别为0.49±0.07、0.44±0.11)较正常组(1.00，P<0.01)均显著降低。 4．RT-PCR结果显示：高脂饮食组及高脂加LPS组PPARγmRNA表达(相对灰度值分别为0.67±0.18、0.75±0.22)均较正常饮食组(0.39±0.11，P<0.05)显著增强，正常加LPS组PPARγmRNA表达(相对灰度值为0.47±0.13)与正常饮食组(0.39±0.11，P>0.05)相比较无统计学差异。 5．胆固醇外流测定结果显示：高脂饮食组细胞胆固醇外流(37％)较正常对照组(25％，P<0.05)明显增强，高脂及正常饮食经LPS刺激后(18％、14％)较正常对照组(25％，P<0.05)均明显减弱，两组间无差异。 6．PPARγ激动剂ciglitazone预处理正常C57小鼠腹腔巨噬细胞，LPS刺激后PPARγ蛋白和mRNA表达(2.65±0.73、0.81±0.25)较正常对照组(1.00、0.42±0.12，P<0.05)升高，IкB-α蛋白表达(0.81±0.12)低于正常组(1.00，P>0.05)。细胞胆固醇外流受到抑制，但抑制程度(11.37％)小于正常对照组(25.72％)。 7．PPARγ反义寡核苷酸预处理正常C57d小鼠腹腔巨噬细胞，LPS刺激后PPARγ蛋白和mRNA表达(0.31±0.11、0.17±0.08)较正常对照组降低(1.00、0.42±0.12，P<0.05)，IкB-α蛋白表达(0.29±0.08)明显低于正常组(1.00，P<0.01)。细胞胆固醇外流受到抑制，但抑制程度(47.82％)高于正常对照组(25.72％)。 结论： 1.LPS刺激增强C57小鼠腹腔巨噬细胞PPARγ表达。 2.LPS刺激抑制C57小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇外流。 3.PPARγ激动剂ciglitazone增强C57小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇外流并能减弱LPS刺激对胆固醇外流的抑制；PPARγ反义寡核苷酸抑制C57小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇外流并增强了LPS刺激对胆固醇外流的抑制。 4.PPARγ能抑制LPS诱导的巨噬细胞NF-кB信号通路活化，从而发挥其抗炎特性，LPS对巨噬细胞胆固醇外流功能的抑制可能同PPARγ的这种抗炎特性有关。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分 不同病理条件下C57小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇外流的变化

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分 PPARγ在内毒素刺激C57小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇外流中的作用

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

附图

文献综述1 PPARγ及其配体对炎症的调控作用

文献综述2 PPARs在胆固醇外流中的作用

致 谢

攻读学位期间完成的论文