小发卡状RNA联合脱氧核酶抑制鼻咽癌EBV-LMP1基因表达的实验研究

摘要

鼻咽癌是我国高发肿瘤，国内外研究证明EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein1，LMP1)在其发生发展中起重要作用，被认为是鼻咽癌的致癌基因。RNA干扰(RNA interference，RNAi)和脱氧核酶(deoxyribozyme，DNAzyme，DZ)技术是能够有效抑制目的基因表达的两种基因治疗策略，已被广泛应用于目的基因功能研究和肿瘤及病毒的基因治疗中。 本研究针对EBV-LMP1 mRNA设计、构建表达小发卡状RNA(short hairpin RNA，shRNA)的重组表达载体(pshRNA-LMP1)，观察pshRNA-LMP1在鼻咽癌细胞内抑制EBV-LMP1基因表达的效率及对鼻咽癌细胞产生的生物学影响，以及联合脱氧核酶抑制EBV-LMP1基因表达的效应，为鼻咽癌的预防和临床治疗提供新的基因治疗策略。 第一部分小发卡状RNA抑制绿色荧光蛋白在鼻咽癌细胞中表达的可行性研究 目的：设计构建针对绿色荧光蛋白(GFP)小发卡状RNA表达载体，观察其在鼻咽癌细胞中对绿色荧光蛋白表达的抑制作用，证实shRNA表达载体诱导的RNA干扰技术在鼻咽癌细胞株中沉默目标基因表达的可行性。 方法：增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染鼻咽癌HNE1细胞并予G418筛选稳定表达GFP的细胞克隆(HNE1-GFP)；设计构建针对GFP的小发卡状RNA表达载体(pshRNA-GFP)；观察不同浓度pshRNA-GFP抑制HNE1-GFP靶基因mRNA、蛋白表达情况及细胞毒性大小。 结果：pshRNA-GFP能够显著抑制鼻咽癌细胞中GFP基因mRNA和蛋白水平的表达且无细胞毒性；pshRNA-GFP1:3和2:5浓度级别组有较高的抑制效率。 结论：特异性小发卡状RNA能够有效抑制鼻咽癌细胞内源性GFP的表达，表明shRNA表达载体介导的RNA干扰在鼻咽癌细胞株中抑制目标基因表达具有可行性。 第二部分 EBV-LMP1荧光融合真核表达载体的构建及荧光可视化筛选细胞平台的建立 目的：构建EBV-LMP1绿色荧光融合蛋白真核表达载体，观察绿色荧光融合蛋白在鼻咽癌细胞的表达情况，为利用该荧光可视化细胞系统筛选高效特异的pshRNA-LMP1建立细胞平台。 方法：从B95-8细胞中提取总RNA，通过RT-PCR扩增EBV-LMP1cDNA片段，构建重组T载体pMD18-T-LMP1m。以重组T载体为模板，构建LMP1绿色荧光融合蛋白真核表达载体pEGFP-N1-LMP1m、pEGFP-C1-LMP1m、pEGFP-N1-LMP1a、pEGFP-C1-LMP1c。在鼻咽癌HNE1细胞中观察融合蛋白荧光表达情况，RT-PCR及westem blot鉴定融合蛋白在HNE1细胞中的表达。 结果：成功构建pEGFP-N1-LMP1m、pEGFP-C1-LMP1m、pEGFP-N1-LMP1a、pEGFP-C1-LMP1c真核表达重组载体，转染HNE1细胞后可见荧光融合蛋白的表达，RT-PCR和westem blot证实LMP1融合蛋白表达成功。 结论：在鼻咽癌HNE1细胞中实现了LMP1蛋白的N端、C端及全长蛋白表达，成功建立了EBV-LMP1相关荧光可视化细胞平台，为进一步进行EBV-LMP1靶向小干扰RNA的荧光可视化筛选奠定了基石出。 第三部分靶向小发卡状RNA在鼻咽癌细胞中的荧光可视化筛选和其效应观察 目的：构建并筛选高效特异抑制鼻咽癌细胞内EBV-LMP1基因表达的靶向小发卡状RNA表达载体(pshRNA-LMP1)，并观察其在鼻咽癌细胞内产生的生物学效应。 方法：设计构建5个pshRNA-LMP1。优化重组质粒pEGFP-N1-LMP1m和pshRNA-LMP1共转染HNE1细胞的条件。观察pshRNA-LMP1抑制荧光融合蛋白表达的高效性和特异性，RT-PCR及Westem Blot检测LMP1mRNA和蛋白表达，MTT检测细胞增值活力、AO/EB检测细胞凋亡、流式检测荧光抑制率。 结果：成功构建5个LMP1靶向小发卡状RNA表达载体：pshRNA-LMP1-130/318/3521/3519/3519c。pEGFP-N1-LMP1m 与pshRNA-LMP1共转染HNE1细胞的最佳比例为0.5μg：1.0μg。筛选出pshRNA-LMP1-3519具有最佳特异性和高效性且无细胞毒性，能有效降低LMP1mRNA和蛋白质表达水平，并能抑制HNE1细胞的生长及促进细胞凋亡。 结论：利用荧光可视化的细胞平台，构建并筛选出高效特异的EBV-LMP1靶向shRNA表达载体pshRNA-LMP1-3519，证实了其在鼻咽癌细胞中的对靶基因沉默作用，及其促进鼻咽癌细胞的凋亡和抑制鼻咽癌细胞的生长的作用。为进一步应用RNA干扰技术抑制鼻咽癌增殖生长等动物实验提供了实验基础。 第四部分靶向小发卡状RNA联合脱氧核酶在鼻咽癌细胞中抑制EBV-LMP1基因表达的研究 目的：观察小发卡状RNA联合脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞中EBV-LMP1基因表达的协同作用，为进一步进行动物及临床试验提供实验依据。 方法：pshRNA-LMP1-3519联合前期实验证实能在鼻咽癌细胞中有效抑制EBV-LMP1表达的脱氧核酶DZ167和DZ509，与重组载体pEGFP-N1-LMP1m共转染HNE1细胞，流式检测荧光抑制率、RT-PCR和Westem Blot分别检测EBV-LMP1基因mRNA和蛋白表达。 结果：荧光表达抑制率分别为pshRNA-LMP1-3519单独干扰组75.15％；pshRNA-LMP1-3519联合DZ167干预组86.31％；pshRNA-LMP1-3519联合DZ509干预组88.88％，流式检测绿色荧光表达率pshRNA-LMP1-3519单独干扰组12.99％，联合干预组5.60％；RT-PCR和Westem Blot均证实pshRNA-LMP1-3519联合DZ167/509干预组能更有效降低EBV-LMP1基因mRNA和蛋白表达。 结论：小发卡状RNA联合脱氧核酶较各自单独应用时可提高抑制EBV-LMP1基因表达的效率。表明RNA干扰和脱氧核酶技术的联合应、用可提高目标基因的抑制效率，为鼻咽癌的基因治疗提供了一种新的策略。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

前言

第一部分小发卡状RNA抑制绿色荧光蛋白在鼻咽癌细胞中表达的可行性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

附图

参考文献

第二部分 EBV-LMP1荧光融合真核表达载体的构建及荧光可视化筛选细胞平台的建立

前言

材料与方法

结果

讨论

附图

参考文献

第三部分靶向小发卡状RNA在鼻咽癌细胞中的荧光可视化筛选和其效应观察

前言

第一节 pshRNA-LMP1沉默EBV-LMP1基因表达的靶点选择

第二节 pshRNA-LMP1在鼻咽癌细胞中的荧光可视化筛选和沉默EBV-LMP1基因表达的效应观察

材料与方法

结果

讨论

附图

参考文献

第四部分 靶向小发卡状RNA联合脱氧核酶在鼻咽癌细胞中抑制EBV-LMP1基因表达的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

附图

参考文献

全文总结

课题创新性

附件论文 一种新型PCR法构建pshRNA-LMP1表达载体的比较研究

文献综述 RNA干扰在鼻咽肿瘤研究中的应用

致谢

攻读学位期间发表文章和申请课题