实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA体系建立及临床应用初步研究

摘要

目的：建立实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA方法，测定重型乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA含量，并进一步探索人工肝支持系统对重型乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA的影响。 方法：用不同浓度质粒标准品建立实时荧光定量PCR标准曲线，并检测该方法的灵敏性及重复性；HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎(轻度)患者血清标本提取物经Plasmid_SafeTM ATP_dependent DNase酶切纯化后进行实时荧光定量PCR反应，验证该方法的特异性。以50例重型乙型肝炎患者人工肝血浆置换治疗前后PBMC作为检测标本，用已建立的实时荧光定量PCR方法对HBV cccDNA含量进行定量检测。用SAS8.1统计软件对结果进行统计学分析。 结果：成功建立了HBV cccDNA实时荧光定量PCR检测方法，线性范围为1×102～2.77x109拷贝/ml。经特异性酶切消化后慢性乙型肝炎(轻度)患者血清中未检测到HBV cccDNA，重型乙型肝炎患者PBMC中存在HBV cccDNA。在人工肝血浆置换前后PBMC中HBV cccDNA含量(中位数log10值)分别为3.73，3.54(n=50，P＞0.05)。血清总HBV DNA与PBMC中HBV cccDNA之间有较好的相关性(r=0.39，P＜0.01)。总HBV DNA水平与PT(r=0.37，P＜0.01)、ALT(r=0.29，P＜0.05)、AST(r=0.39，P＜0.01)水平呈正相关；HBV cccDNA水平与PT(r=0.34，P＜0.05)、ALT(r=0.34，P＜0.05)、AST(r=0.40，P＜0.01)水平呈正相关。 结论：本研究结果显示，所建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的线性范围、灵敏度、特异性及重复性。重型乙型肝炎患者PBMC中存在HBV cccDNA。血清总HBV DNA与PBMC中HBV cccDNA呈正相关；总HBV DNA、HBV cccDNA与PT、ALT、AST呈正相关，说明总HBV DNA、HBV cccDNA均能在一定程度上反映肝脏损伤程度且有较好的一致性。在人工肝血浆置换后重型乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA含量无明显降低。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

第一部分 实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA体系的建立

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

第二部分 人工肝支持系统对重型乙型肝火患者PBMC中HBV cccDNA影响的初步研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

文献综述 乙型肝炎病毒cccDNA研究近况

致谢

攻读学位期间发表的学术论文