呼吸道合胞病毒感染后气道上皮细胞株Toll样受体表达及其功能研究

摘要

目的：为了解TLR家族在RSV诱导气道上皮细胞炎症反应中的作用，体外培养9HTEo人类气道上皮细胞株，观察RSV感染后，9HTEo细胞TLR1-10 mRNA的表达变化。 方法：RSV以MOI为10感染9HTEo细胞3小时后用半定量RT-PCR检测TLR1-10 mRNA表达；感染3、6和9小时后用Q-PCR检测TLR1-10 mRNA的动态变化，并以UV-RSV作为对照。 结果：RT-PCR结果提示RSV感染上皮细胞后TLR2～10mRNA表达均上调，以TLR2和TLR6变化最为显著；Q-PCR结果显示：（1）9HTEo细胞株可表达TLR1-10 mRNA，其中以TLR4和TLR8 mRNA表达最高；（2）RSV感染上皮细胞6小时和＼或9小时后，TLR1-10mRNA均表达增高，而UV-RSV组TLRl-10mRNA无明显变化。 结论：RSV感染气道上皮细胞株后，TLR1-10 mRNA均被上调，而无复制能力的RSV不能引起TLR1-10mRNA表达的变化，提示RSV诱导TLRs mRNA表达与病毒入胞复制有关。 目的：观察RSV感染后，气道上皮细胞TLR4蛋白表达变化及其信号通路的功能，与RSV在细胞复制的关系，进一步探讨RSV诱导气道炎症的可能机制。 方法：体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-，RSV以MOI为10感染上皮细胞24小时后（1）用流式细胞术检测TLR4表达及与凋亡的关系；（2）用ELISA检测RSV感染上皮细胞经LPS刺激，并加入TLR4阻断剂HTA125后，上清液中IL-8，IL-6和RANTES的含量；（3）运用TLR4特异性的siRNA干扰9HTEo细胞TLR4表达后，接种RSV并予以LPS刺激，用ELISA法检测上清液中IL-8，IL-6的水平。用TLR4特异性siRNA干扰9HTEo细胞24小时后，①RSV以MOI为0.1感染细胞，连续3天收集上清液用Adeasy TCID50法检测RSV感染性滴度的变化；②RSV以MOI为10感染细胞48小时，ELISA方法检测上清液中IL-8，IL-6，TNF-α和MCP-1的变化；③RSV以MOI为10感染细胞24小时后，用流式细胞术检测细胞凋亡情况。 结果：RSV感染9HTEo上皮细胞，膜上TLR4表达增高而胞内TLR4表达降低，TLR4阳性细胞百分比明显增加，其中绝大部分为膜Annexin V阳性细胞；LPS诱导的IL-6和部分IL-8可被HTA125阻断，RANTES无明显变化；在TLR4表达被干扰的情况下，LPS刺激仅能诱导产生部分IL-8，不能诱导产生IL-6。TLR4-siRNA组的RSV滴度变化与正常9HTEo细胞组无统计学差异；RSV诱导的IL-6和MCP-1水平在TLR4-siRNA200nM组明显低于对照组，而IL-8和TNF-α的水平无明显变化；TLR4-siRNA组RSV诱导AnnexinV阳性同时PI阴性的细胞群体百分比在TLR4-siRNA组明显高于对照细胞组。 结论：RSV感染9HTEo细胞后，LPS再刺激产生IL-6是依赖于TLR4信号通路。气道上皮细胞TLR4通路与RSV复制、RSV诱导上皮细胞分泌IL-8无关，但与病毒诱导上皮细胞分泌IL-6和MCP-1，以及病毒感染细胞发生凋亡有关。 目的：观察RSV感染9HTEo上皮细胞后，TLR3蛋白表达变化及其信号通路的功能。 方法：体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-，RSV（1）以MOI为1感染上皮细胞24小时后，提取细胞总蛋白，用Westernblot的方法检测TLR3表达的变化，以TLR3激动剂PolyIC刺激为对照；（2）以MOI为10接种上皮细胞4小时后，直接加入PolyIC到培养上清或用脂质体将PolyIC转染至细胞内刺激48小时后，用ELISA检测上清液中IL-8，IL-6，IFN-α和IFN-β的表达。 结果：RSV感染后9HTEo上皮细胞后，TLR3蛋白表达量明显增高，再经胞内TLR3激动剂PolyIC刺激后，培养上清IL-8，IL-6和IFN-β含量明显增加。 结论：RSV诱导上皮细胞TLR3蛋白表达增高，TLR3通路可介导IL-8和IL-6和少量IFN-β产生，提示TLR3通路可能主要诱导上皮细胞炎症反应而不是抗病毒反应。 目的：以地塞米松和利巴韦林为对照，观察白藜芦醇对RSV复制和对RSV诱导的上皮细胞炎症反应作用及其机制研究。 方法：（1）体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-细胞和Hep-2细胞株，RSV以MOI为0.1接种Hep-2细胞和9HTEo细胞4小时后，加入适宜浓度的白藜芦醇，地塞米松和利巴韦林，连续5天收集各组上清液，用AdeasyTCID50方法检测计算RSV滴度的变化；（2）体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-细胞，RSV以MOI为10接种9HTEo细胞4小时，将PolyIC转染至细胞内后再加入适宜浓度白藜芦醇，地塞米松或利巴韦林至48小时后，用ELISA检测上清液中IL-8，IL-6的表达。（3）体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-细胞，RSV以MOI为1接种9HTEo细胞4小时，加入适宜浓度白藜芦醇，地塞米松或利巴韦林，48小时后收集细胞提取蛋白用Westernblot检测TLR3蛋白，TRIF蛋白和TBK-1蛋白表达的变化。 结果：Hep-2细胞-白藜芦醇100μM处理组和9HTEo细胞-白藜芦醇处理组的RSV滴度明显低于单纯RSV组，相应细胞的地塞米松处理组的RSV滴度无明显变化，而利巴韦林组的RSV滴度明显低于单纯RSV组。RSV感染9HTEo细胞后，白藜芦醇组和地塞米松组的IL-6水平明显降低，但IL-8无明显变化，利巴韦林组的IL-8和IL-6水平明显降低；RSV感染9HTEo细胞后再给与胞内PolyIC刺激后，白藜芦醇组，地塞米松组的IL-8和IL-6水平均明显降低，而利巴韦林组IL-8和IL-6无明显变化。RSV感染9HTEo细胞后，白藜芦醇处理组的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表达明显降低，TLR3蛋白无明显变化；地塞米松组和利巴韦林组的TLR3蛋白，TRIF蛋白和TBK-1蛋白的表达均明显降低。 结论：白藜芦醇可抑制RSV在气道上皮细胞中的复制和抑制dsRNA-TLR3通路的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表达，从而抑制RSV诱导上皮细胞分泌的IL-6，提示白藜芦醇抑制RSV感染后气道炎症反应的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分RSV感染气道上皮细胞株TLR1-10 mRNA表达

1材料与方法

2结 果

3讨论

4参考文献

第二部分RSV感染后气道上皮细胞株TLR4蛋白表达及其功能研究

1材料和方法

2结 果

3讨论

4参考文献

第三部分RSV惑染后气道上皮细胞株TLR3蛋白表达及其功能研究

1材料和方法

2结 果

3 讨论

4参考文献

第四部分白藜芦醇抑制RSV感染气道上皮细胞株炎症介质的产生及其机制研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4参考文献

全文小结

文献综述Toll体受家族与人类呼吸道合胞病毒的天然识别

致谢

攻读博士期间发表论文