超顺磁性壳聚糖明胶微球载BMP和VEGF基因促进骨缺损愈合的初步研究

摘要

目的：观察振荡磁场和/或静磁场下超顺磁性壳聚糖明胶微球载VEGF165和/或BMP9基因对促进生物活性人工骨血管化和骨缺损愈合的作用。 方法：（1）制备大量能够在真核细胞中表达人BMP9和人VEGF165的质粒。分别用PvuⅡ、SalⅠ和SacⅡ、HandⅢ双酶切后，行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，并对质粒进行DNA序列测定，用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度。（2）用化学共沉淀法制备超顺磁性壳聚糖纳米微球（SPFCN），扫描电镜和振动样品磁强计等仪器对合成的SPFCN进行形态观察和结构表征。（3）用交联固化法制备超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球（SPCPGM）。（4）用纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨水泥（四川大学纳米生物材料研究中心提供）制备中空带侧孔的仿兔桡骨中段骨缺损修复支架，将一定量的两种超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球分别填入中空支架中。（5）选用新西兰兔48只，建立兔桡骨双侧骨缺损模型，随机分为（A组）SPCPGM（BMP9+VEGF165）+振荡磁场+静磁场；（B组）SPCPGM（BMPg+VEGF165）+静磁场；（C组）SPCPGM（VEGF165）+振荡磁场+静磁场；（D组）SPCPGM（VEGF165）+静磁场。术后2周、4周、8周、12周，搜集标本，通过大体观察，X线检测，组织切片光学显微镜观察，求积仪测量和计算机图像分析系统分析等方法对生物活性人工骨血管化和成骨情况进行定性及定量测定，将获得的数据进行统计学分析，以评估四种不同处理组成骨的情况。 结果：（1）两种质粒（pAdTRACKBMP9.pDsVEGF165）经扩增、纯化后，PvuⅡ、SalⅠ和SacⅡ、HandⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析鉴定显示：BMPg片段大小（1290bp），VEGF165片段大小（573bp）与预期相符；基因序列测定结果表明，基因序列正确。用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪检测BMPg质粒浓度为0.49±0.09mg/ml；VEGF165质粒浓度为0.37±0.06mg/ml。（2）扫描电镜下Fe3O4纳米粒外形呈椭圆形或圆形，均匀度好，粒径为23；3.47nm。振动样品磁强计检测显示制备的超顺磁纳米微球具有超顺磁性。（3）制备SPCPGM时，SPFCN与pAdTRACKBMP质粒和pDsVEGF165质粒结合时的最适氮/磷（N/P）比例为2.5/1。（4）磁场（振动磁场和/或静磁场）下SPCPGM促进人工骨成骨的体内实验研究表明：①SPCPGM（BMP9+VEGF165）促进生物活性人工骨血管化和成骨作用效果，优于单独使用SPCPGM（VEGF165）。②静磁场和振动磁场联合应用，能够明显提高SPCPGM体内局部成骨作用，4周时已有大量成骨。③促进成骨的作用的顺序：1）SPCPGM（BMP9+VEGF165）+振荡磁场+静磁场；2）SPCPGM（VEGF165）+振荡磁场+静磁场；3）SPCPGM（BMP9+VEGF165）+静磁场≈4）SPCPGM（VEGF165）+静磁场。④振动磁场的应用，能够促使局部磁性微球残留量的明显减少。 结论：超顺磁性壳聚糖明胶微球载BMP9、VEGF165两种基因促进生物活性人工骨血管化和成骨的效果，优于单载VEGF165基因；在振动磁场应用，能够明显提高SPCPGM体内人工骨血管化和成骨作用，并能够促使局部磁性微球残留量的明显减少，这对避免局部药物残留可能造成的近期或远期的不良后果具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

第一部分：真核表达质粒的扩增、纯化和鉴定

1.实验材料

2.实验方法

3.结果与讨论

4.结论：

5.参考文献

第二部分：超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球的制备

1.实验材料

2.实验方法

3.结果与讨论

4.结论

5.参考文献

6.论文图片

第三部分：磁场下超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球促进人工骨成骨的体内实验研究

1.实验材料

2.实验方法

3.结果与讨论

4.结论：

5.参考文献

6.论文图片

全文总结

全文结论

文献综述：BMP和VECF在骨组织过程中的协同作用

致谢

攻读学位期间撰写的学术论文