DNA生物传感器快速检测病原微生物的实验研究

摘要

随着分子生物学和生物技术的发展，DNA分子识别技术不断提高。相比传统的以微生物表型特征为基础的检测方法，基于DNA识别技术的分子生物学检测方法，具有快速、敏感性和特异性高的优点，非常适用于病原微生物的临床检测和鉴定。同时随着越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定，这些巨量的信息为我们开启了进行大量生物学分析和检测的大门。DNA生物传感器是集分子生物学、现代物理、现代化学、微电子技术于一体的新型基因分析技术，具有快速、敏感、高效、高通量等优点，在生物工程、临床医学、环境监测、食品分析等领域具有重要的意义。目前已有包括光学传感器、石英晶体传感器、电化学传感器等众多类型的DNA传感器，根据是否选用标记物，这些传感器可分为标记型和非标记型两大类。标记型DNA传感器对DNA的识别，是通过检测DNA上标记的信号分子所引起的光学、电化学等信号的改变。非标记型DNA传感器则直接检测DNA杂交形成复合体过程中引起的光学、质量以及电化学的改变。 本研究主要分两部分，第一部分我们将真菌核糖体分型技术、DNA生物传感器技术和纳米金信号放大技术相结合，以纳米金为信号分子，建立了一种适合临床实验室应用的病原性真菌检测DNA传感器检测系统。第二部分我们将表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）传感器技术与肽核酸探针技术相结合，对无信号分子的DNA的直接、简便、快速检测方法进行了初步探索。 实验的主要方法及结果如下： 第一部分基于纳米金的标记型生物传感器同时检测多个病原性真菌。 1.通过查阅文献报道并进行临床调查，确定以20余种临床常见的病原性真菌为检测目标，包括念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、皮肤癣菌等。 2.通过临床常见病原性真菌，包括酵母菌、浅部真菌和深部真菌共14个属30种真菌的核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）基因序列的比对，以真菌5.8S rRNA基因和28S rRNA基因的保守序列，设计真菌通用引物，可扩增真菌5.8S rDNA部分序列、ITS2（内转录间隔区2）全序列、28S rDNA的部分序列。利用该通用引物建立了真菌rRNA基因通用PCR扩增方法并进行了优化。该通用PCR方法对20种靶真菌均可扩增出目的DNA带，大小在259～531 bp之间。所有非真菌样品扩增结果均为阴性。 3.为简化PCR方法和减少标本用量，利用基因释放剂直接制备病原性真菌DNA模板。该方法操作非常快速、简单，整个模板制备过程仅需30min左右，而传统方法通常都需要2h以上。 4.在相同条件下利用AlleleID6.0软件设计了针对各靶真菌ITS2序列的种特异性寡核苷酸探针，利用生物信息学方法对所有探针进行分析筛选，并利用反向膜杂交技术进行验证。结果表明所选用探针特异性强、可靠性好，且探针间Tm值相差仅1℃，具有相同的杂交条件。 5.建立并优化了纳米金显色目视DNA芯片检测系统，包括：最佳点样探针浓度；最适杂交温度、杂交时间；最佳银染显色方法；自身质量控制系统。该技术具有很好的特异性，对热带念珠菌扩增产物和白色念珠菌的检测敏感性分别达到50fmol/L和10cfu/ml，且检测结果可以用肉眼直接观察或普通光学仪器记录。 6.为验证该检测技术用于临床样品检测的可靠性和实用性。用该检测系统对临床样品直接进行检测，分别检测了真菌感染标本的阳性培养物、加入标准菌株制备的模拟临床标本以及含菌的临床标本。本法的检测结果与常规经典检测鉴定方法结果一致；证明本检测方法准确可靠，可用于临床样品的检测。 以上结果表明：我们建立的通用PCR结合纳米金DNA传感器技术，具有敏感、特异、操作简单快速的优点。整个检测过程可在6h内完成，而传统方法需要2～4天。与传统的基因芯片技术相比，其技术和设备要求、检测成本大大降低。能部分满足临床检测的通量要求，适合在临床开展，有望成为临床微生物实验室传统真菌检测技术理想的替代方法。 第二部分基于SPR和bis-PNA的非标记型生物传感器。 1.采用一种全新的二维SPR折射率成像方法-“并行扫描光谱表面等离子体共振成像方法”。这项技术具有SPR传感器一贯的高折射率灵敏度的特点，且能提供定量的被测平面的二维折射率分布图，其中每点的亮度值与折射率直接线性对应；本方法采用线形光束照明探测，一次探测一维区域，扫描探测二维平面区域，探测速度快，具有很高的信息通量。 2.针对流感病毒M基因，设计合成了bis-PNA探针。其中Hoogsteen链的C碱基用J（pseudoisocytosine）碱基检测替换，消除了C碱基在杂交过程中需要质子化的影响，使探针在中性杂交环境中具有较好的稳定性，既保证其高结合率又有较好的特异性。 3.将巯基修饰的bis-PNA探针固定在金膜上，制成微阵列，直接与甲型流感病毒M基因扩增产物杂交，然后进行SPR扫描分析。该技术检测敏感性为1pmol/L的双链DNA分子。 结合并行扫描光谱表面等离子体共振传感器系统和bis-PNA技术，我们构建了一种无需任何标记的生物传感器技术，并进行了初步验证。结果表明该方法可直接检测双链DNA，无需对其进行变性处理。具有操作简单快速、检测通量高的优点。但目前离实际应用还有一段距离，在探针的设计、杂交条件、检测系统的稳定性等方面还需进一步优化提高。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分基于纳米金的标记型生物传感器同时检测多个病原性真菌

引 言

第一节 病原性真菌rRNA基因通用PCR扩增方法的建立

1.材料与方法

2.试验结果

3.讨论

第二节 基于纳米金的病原性真菌检测DNA芯片的构建

1.材料与方法

2.试验结果

3.讨论

第三节 双探针法直接检测真菌核酸的实验研究

1.材料与方法

2.实验结果

3.讨论

附表

参考文献

第二部分 基于SPR和bis-PNA的非标记型生物传感器

引言

1.材料与方法

2.试验结果

3.讨论

参考文献

全文总结

文献综述：纳米金微粒在DNA生物传感器研究中的应用

致 谢

攻读博士学位期间发表的论文、研究生期间参编专著、申请专利及获得科研基金资助