他克莫司对大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎的实验性治疗

摘要

目的：本研究应用免疫抑制剂他克莫司（FK506，tacromulis）对多发性硬化的动物模型--实验性变态反应性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE）大鼠进行治疗，通过观察实验动物的临床表现及中枢神经系统（central nervous sysyem，CNS）的病理改变、外周血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8、NK细胞比率、神经元生长锥的主要磷酸蛋白成分生长相关蛋白-43（Gap-43，Growth Associated Protein43）的表达，探讨他克莫司对EAE的治疗作用及其作用机制，并与传统的治疗方法泼尼松龙作为对比，为临床治疗多发性硬化提供实验依据。 方法：（1）采用豚鼠全脊髓匀浆和完全福氏佐剂（complete freund's adjuvant，CFA）制成的混合液作为抗原，同时皮内注射百日咳疫苗，复制多发性硬化的动物模型SD大鼠急性EAE。（2）将实验动物随机分为5组，正常对照组（n=5）、EAE模型组（n=10）、FK506A组（n=10）、FK506B组（n=10）、泼尼松龙对照组（n=10）。自免疫后第10天起开始治疗，FK506A组以他克莫司1mg/kg/d，FK506B组以他克莫司0.5m g/kg/d的剂量连续腹腔注射10天，泼尼松龙对照组10mg/kg/d的剂量连续腹腔注射10天，EAE组用同量生理盐水代替。（3）免疫后每日观察实验动物的体重变化并进行临床评分；免疫后20天，采各组大鼠尾静脉血EDTA抗凝，用流式细胞仪法测T淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+8、和NK细胞比率变化；免疫后30天处死各组全部大鼠，做HE、Luxol Fast Blue-H.E.髓鞘染色、Bielschowsky轴突银染色检查观察中枢神经系统的病理改变；GAP-43免疫组织化学染色观察中枢神经系统轴突再生的形态学依据。 结果：（1）复制模型的大鼠出现临床表现、病理改变均符合急性EAE的病变特点。（2）EAE对照组大鼠临床症状高峰评分为（3.02±0.98），体重减低最大值为（39.62±13.64）g，免疫后发病时间为（10.21±1.08）d，临床病程持续（16.52±0.83）d。FK506A组大鼠临床症状高峰评分为（1..21±0.31），体重减低最大值为（12.52±5.26）g，免疫后发病时间为（14.61±1.74）d，临床病程持续（10.34±0.61）d。FK506B组大鼠临床症状高峰评分为（1.52±0.36），体重减低最大值为（11.34±5.19）g，免疫后发病时间为（14.08±1.39）d，临床病程持续（10.91±1.21）d.，泼尼松龙对照组大鼠临床高峰评分为（1.67±0.22），体重减低最大值为（-26.12±7.34），免疫后发病时间为（10.41±0.81）d，临床病程持续（18.77±0.56）d。HE染色显示，EAE组大鼠脑、小脑、脊髓的炎症细胞浸润评分分别为（2.61±0.47）、（3.17±0.29）、（3.86±0.44），FK506A组大鼠脑、小脑、脊髓的炎症细胞浸润评分分别为（1.31±0.54）、（1.94±0.27）、（2.08±0.23），FK506B组大鼠脑、小脑、脊髓的炎症细胞浸润评分分别为（1.27±0.69）、（1.87±0.35）、（2.12±0.76），泼尼松龙对照组大鼠脑、小脑、脊髓的炎症细胞浸润评分分别为（1.12±0.41）、（2.31±0.14）、（2.29±0.58）。Luxol Fast Blue-H.E。髓鞘染色显示，EAE组大鼠脑、小脑、脊髓的髓鞘脱失评分分别为（1.59±0.83）、（2.07±0.74）、（2.21±0.51），FK506A组大鼠脑、小脑、脊髓的髓鞘脱失评分分别为（0.86±0.31）、（1.29±0.64）、（1.44±0.52）、FK506B组大鼠脑、小脑、脊髓的髓鞘脱失评分分别为（0.87±0.17）、（1.34±0.48）、（1.51±0.72），泼尼松龙对照组大鼠脑、小脑、脊髓的髓鞘脱失评分分别为（0.81±0.33）、（1.27±0.58）、（1.17±0.28）。Bielschowsky轴突银染色显示EAE组脊髓轴突损伤评分为（1.91±0.64）、FK506A组显示脊髓轴突损伤评分（1.17±0.26）、FK506B组显示脊髓轴突损伤评分（1.31±0.37），泼尼松龙对照组脊髓轴突损伤评分为（1.06±0.14）。EAE组、FK506A组、FK506B组、泼尼松龙对照组外周血CD3+T淋巴细胞比率分别为（67.22±1.21）、（58.17±0.96）、（60.28±2.13）、（71.06±3.83）。EAE组、FK506A组、FK506B组、泼尼松龙对照组大鼠外周血CD4+T淋巴细胞比率分别为（51.27±2.13）、（41.34±1.41）、（44.12±2.69），（55.21±4.78）0 EAE组、FK506A组、FK506B组、泼尼松龙对照组大鼠外周血CD8+T淋巴细胞比率分别为（28.16+1.53）、（14.43±0.74）、（13.2±1.17）、（26.34±1.72），EAE组、FK506A组、FK506B组，泼尼松龙对照组大鼠外周血NK细胞比率分别为（8.52±1.16）、（1.07±0.41）、（1.89±0.21）、（7.62±0.49），EAE组CD4+/CD8+比值为（1.82±0.26），FK506A组CD4+/CD8+比值为（2.61±0.21），FK506B组CD4+/CD8+比值为（2.84±0.51），泼尼松龙对照组CD4+/CD8+比值为（2.09±0.38）。EAE组、FK506A组、FK506B组、泼尼松龙对照组大鼠中枢神经系统中GAP-43免疫组织化学染色中阳性细胞数分别为（195.96±21.51）、（454.52±17.63）、（397.19±19.09）、（211.61±12.51）。 结论：（1）本研究中复制的急性EAE模型成功、稳定、可靠。（2）他克莫司对急性EAE有一定的治疗作用，具有有效改善EAE的临床表现，减轻中枢神经系统的炎症损害、髓鞘脱失、和神经轴突的损伤。（3）他克莫司治疗组停药后，未见临床症状复发，他克莫司具有明显延缓EAE的临床发病时间和缩短临床病程时间。（4）他克莫司对EAE大鼠的治疗可能是与抑制T细胞免疫有关，还可能通过促进中枢神经系统的轴突再生来发挥其治疗作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

附图

文献综述 多发性硬化的轴索损伤

致谢

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