内源性大麻配体及大麻受体药物对脑缺血再灌注神经元损伤保护作用的初步研究

摘要

　　 缺血性脑血管疾病是中老年人最常见危及生命的神经疾病。中风是人类第三大致死因素，人类在中风上的花费越来越多也越来越大，而幸存者往往伴随有残疾和部分功能的丧失。国内外针对缺血性脑血管疾病病理机制研究和治疗药物的开发从未停止过。目前临床已经有一些新药例如t-PA等用于脑血管疾病的保护和治疗，但这些神经保护药物在临床应用中的表现往往并不能令人满意。此类药物大多存在治疗时间窗窄，不良反应较多等问题，在脑血管疾病发生损伤时可供选则的有效神经保护药物缺乏成为临床治疗这一类疾病的“瓶颈”。现在，寻找选择新的药物作用靶点和用于治疗脑血管疾病类的新药仍然是当务之急。
　　 大麻（cannabis，marijuana）英文名来源伊拉克南部幼发拉底河苏美尔人。大麻是世界上最古老、最有名并且使用人群最广泛的的致幻剂。中国最早在大约4000年前就将大麻用于生产生活和医学治疗用途。大麻可以产生令人愉悦的状态，包括虚幻的感觉，欣快感；此外大麻还具有镇痛，止吐，引起共济失调，心动过速，体温降低，降低眼压，引起短期记忆出现缺失等作用特点。大麻中的主要有效化学成分是△9-THC。大麻具有许多药理作用，但是一直以来由于大麻类提取物常常被滥用，并且产生不良精神症状和较明显的成瘾性，这些负面的作用影响了人们对于大麻药物进一步研究热情。
　　 1988年，Matsuda等发现了大麻受体亚型CB1受体，它们主要分布于中枢和外周神经组织；这两种大麻受体均为G蛋白偶联受体，具有与很多其他G蛋白类受体相似的特点，如大麻受体结构中都包括有7次跨膜的α螺旋结构。大麻受体CB1在脑部分布于苍白球，纹状体，黑质，海马，在小脑和大脑皮层均有较高密度大麻受体亚型CB1分布。此外在睾丸，输精管，子宫，肺，小肠，血管平滑肌细胞和内皮细胞均发现CB1受体的存在。大麻CB1受体结合了多条信号转导通路。1993年Munro等成功克隆大麻受体CB2受体，最早的研究发现CB2存在于外周组织。CB2主要分布于脾，扁桃体，淋巴结等免疫器官，大麻受体CB2在巨噬细胞/单核细胞，B淋巴细胞，NK细胞（自然杀伤）细胞，嗜酸性粒细胞和白细胞中均具有较高表达量。人们普遍认为大麻受体CB2与人体内炎症反应具有密切关系。1992年以色列的Devane等研究室首次从猪脑中提取出一种内源性大麻素样物质：花生四烯酸乙醇胺（N-Arachidonoylethanolamine，anandamine，AEA），随后又从大鼠脑中分离出了2-花生四烯酸甘油（2-Arachidonoglycerol，2-AG），这两种大麻内源性配体具有与大麻植物提取物△9-THC极为相似的三维结构，并且在体内和体外实验中也产生和△9-THC相似生理作用。这两种大麻内源性配体结构均属于花生四烯酸类衍生化合物。在哺乳动物体内AEA浓度远远高于2-AG浓度，目前它们是被公认哺乳动物体内作用于大麻受体的内源性大麻配体。大麻受体、内源性大麻素和它们在生物体内的合成酶及降解酶共同构成了大麻系统（Theendocannabinoid signaling system，ECS）。大麻特异性受体和大麻内源性配体的发现引起了对大麻系统研究的热潮。大麻系统存在的发现，宣示了一个新的脑啡肽时代的来临。
　　 人类发现的第一个大麻内源性配体-花生四烯酸乙醇胺是人体内大麻受体CB1和CB2受体最主要内源性配体之一。它广泛存在于哺乳动物体内许多组织中，如脑组织、心脏、脾脏和子宫等组织，通过大麻系统作用发挥对哺乳动物内许多复杂生理过程的调节。由于大麻系统对不同代谢失调或疾病具有神经递质水平的调节作用，大麻系统中大麻内源性配体和大麻受体从一开始被发现就一直是人们研究重点。由于大麻系统作用非常复杂，关于大麻配体在许多疾病中的作用现在仍然存在着许多争论的焦点；调节大麻受体也是大麻系统方向研究的重要内容，特别是在代谢性失衡或神经性损伤疾病中进行调节大麻受体CB1/CB2产生的作用主要是保护作用还是造成负面损伤恶化症状也存在较大争执。事实上，调节大麻系统大麻受体CB1/CB2受体的活性，发挥大麻系统药物在脑缺血再灌注的保护作用是目前脑神经保护研究领域的新热点。
　　 目的：
　　 1.建立稳定可靠的柱前衍生化高效液相色谱法，分离和分析生物样品中大麻内源性配体花生四烯酸乙醇胺的方法；
　　 2.通过测定哺乳动物体内不同组织器官和体液中大麻内源性配体花生四烯酸乙醇胺的分布情况，进一步加深对大麻系统的认识和了解；
　　 3.建立大鼠缺血再灌注模型，检测大鼠脑内花生四烯酸乙醇胺在缺血/再灌注发生时所产生的变化，并对变化可能产生的作用进行讨论：
　　 4.建立脑缺血/再灌注联合用药大麻受体CB1拮抗剂和大麻受体CB2激动剂的给药方案，进一步探讨通过调节大麻系统在脑缺血再灌注过程产生保护作用的药物新组合方案和药物作用的机制。
　　 方法：
　　 1.首先使用荧光衍生化试剂DBD-COC1衍生化花生四烯酸乙醇胺，通过高效液相色谱法对衍生化合物进行分离，分析；同时对方法学可靠性进行验证；
　　 2.摘取哺乳动物体内不同组织器官和体液，样品处理后，柱前衍生化高效液相色谱法分离测定样品中花生四烯酸乙醇胺的含量；
　　 3.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，分别在不同时间测定处死脑缺血再灌注大鼠，取脑组织，高效液相色谱法测定组织中花生四烯酸乙醇胺的含量变化；
　　 4.建立大鼠脑缺血再灌注模型，通过联合用药大麻受体CB2激动剂和大麻受体CB1拮抗剂，首先进行神经功能学评分，然后检测大鼠脑部梗死体积和大鼠局部缺血区域血流量变化，通过实验对联合用药调控大麻系统受体用于脑缺血治疗这一新给药方案及机制进行初步讨论。
　　 结果及结论：
　　 1.成功建立了柱前衍生化高效液相色谱法测定生物体内花生四烯酸乙醇胺；我们建立的柱前衍生化高效液相色谱法可以成功用于不同生物体组织或体液中花生四烯酸乙醇胺的分析测定；同时完成对哺乳动物体内不同组织和体液中花生四烯酸乙醇胺的测定；不同组织器官和体液中，大麻内源性配体花生四烯酸乙醇胺浓度含量存在显著差异，这可能与大麻系统在不同部位具有的复杂调控功能和不同生理作用有关；
　　 2.在缺血再灌注损伤发生时，AEA浓度明显升高，AEA是具有保护作用的，作用机理可能包括多条信号通路的激活，如抑制钙离子通道，减少水肿症状，产生体温降低等机制发挥保护作用；脑缺血再灌注下大鼠脑内对侧半球花生四烯酸乙醇胺浓度明显升高，预示模型大鼠全脑都参与了缺血再灌注后的生化过程并且花生四烯酸乙醇胺在这一过程中发挥了神经保护作用：实验结果还表明随着时间延长，脑半球两侧AEA浓度水平差异减小，脑部AEA在缺血后发生再分布。
　　 3.联合用药后缺血再灌注大鼠神经功能学评分明显改善，局部血流量增加，脑梗死体积较小；大麻素受体CB2激动剂联合大麻受体CB1拮抗剂通过改善局部缺血区域脑血流量和减小梗死面积对脑缺血再灌注造成的损伤产生了保护作用。