低强度脉冲超声促进骨髓间充质干细胞增殖及其机制的初步探讨

摘要

组织工程的核心是运用工程科学与生命科学的原理和技术,研究与开发具有生命力且与机体病损组织或器官形态和功能相一致的生物体,以期恢复、维持和改善相关组织或器官形态和功能的一门新兴学科。迄今,国内外组织工程研究已取得令人瞩目的研究成果,展现了修复与重建外科应用的美好前景。
　　 组织工程化组织或器官能否构建成功,种子细胞的选择、处理和应用成为了组织工程技术中需要解决的关键问题,无论采用何种种子细胞构建组织工程化组织或器官都需要大量的种子细胞。种子细胞的扩增要求提高扩增效率,短时间内获取足够数量的细胞,因此组织工程对扩增种子细胞的技术手段要求较高。种子细胞的数量不足成为了组织工程产品产业化的制约因素。针对此问题,主要的解决手段及其不足有:(1)生长因子的应用:致基因突变的危险性大,量效关系不清；(2)改善种子细胞培养体系:存在诸多技术上的缺陷,难以完全模拟体内微环境,且费用昂贵；(3)转基因技术:转染效率低,体内表达时间短。上述扩增种子细胞的方法都存在各自的弊端及不完善之处,因此越来越多的学者都在寻求一种更为有效的技术手段。
　　 低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)的发射方式为脉冲式,且剂量可低至30mw/cm2以下,对人体组织不会有损伤。目前,LIPUS已经广泛应用于骨与软组织创伤的愈合,使用安全,效果显著。近年来随着对LIPUS诸多研究的展开,LIPUS在其他领域的应用也越来越受到重视,特别是其在细胞生物学方面的重要作用,能促进体外成纤维细胞、成骨细胞等细胞的增殖和细胞外基质的分泌。而现在种子细胞应用的较多的是骨髓间充质干细胞,由此,本课题将LIPUS和骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)结合起来,探索能否找到体外扩增组织工程的种子细胞的新途径。
　　 目的：
　　 1.观察LIPUS在不同培养条件下(正常干细胞培养体系和低血清培养体系)对BMSCs增殖的影响,探讨LIPUS在组织工程中扩增种子细胞的可行性。
　　 2.探索LIPUS影响BMSCs增殖的机制,为LIPUS促进BMSCs的增殖提供理论依据。
　　 方法：
　　 1.为筛选后续研究的最佳细胞接种密度,将第三代BMSCs以3×103个/ml,5×103个/ml,1×104个/ml,5×104个/ml四种密度各接种于16块6孔板中,2ml/孔,每板1、2、3号孔为超声照射组(LIPUS组),4、5、6号孔为空白对照组。采用100mw功率的脉冲超声照射,脉冲宽度为800ms,脉冲间歇为200ms,超声照射组每天每孔照射20min。每天镜下观察细胞生长情况,于照射前、照射后1d、3d、5d行MTT检测。
　　 2.(1)将正常干细胞培养体系下的第三代BMSCs以筛选出的最佳的观察密度--1×104个/ml密度接种于16块6孔板中(2ml/孔),随机分为LIPUS组和空白对照组,每组8个板,照射方案及检测方法同前；(2)将第三代BMSCs接种于一次性培养瓶中培养,并分为LIPUS组、空白对照组,每天每瓶照射20min,并于照射前、照射后1d、2d、3d、4d、5d、6d、8d、10d行流式细胞仪检测细胞周期变化。
　　 3.(1)采用胎牛血清含量为5ml/L的培养液培养第三代的BMSCs,将大部份BMSCs的细胞周期阻滞在G0/G1期状态；(2)将所培养的BMSCs以1×104个/ml接种于16块6孔板中,随机分为LIPUS组和空白对照组,每组8个板,照射方案及检测方法同前:(3)将低血清培养条件下的BMSCs接种于一次性培养瓶中培养,并分为LIPUS组、空白对照组,照射方案同前,并于照射前,照射后1d、3d、5d行流式细胞仪检测细胞周期变化。
　　 4.将正常干细胞培养体系下和低血清培养体系下培养的第三代BMSCs接种于一次性培养瓶中培养,分组及照射方案同前,并于照射前、照射后1d、3d、5d、7d行RT-PCR检测各组细胞Bmi-1基因mRNA的表达指数；并同时检测原代BMSCs的Bmi-1基因mRNA的表达。
　　 结果：
　　 1.形态学观察示:各密度组细胞均呈长梭形,多角形,折光性强。3×103组:照射前、照射后各天镜下观察LIPUS组和空白对照组的细胞均散在分布,集落稀疏,观察两组细胞生长情况无明显差异；5×103组:镜下观察LIPUS组于照射1d后细胞即形成簇状增生灶,而空白对照组细胞仍呈单个散在生长,照射3d、5d后镜下观察LIPUS组和空白对照组细胞均呈簇状生长,但LIPUS组细胞集落更为密集；1×104组:LIPUS组于照射后各天细胞分裂增殖较空白对照组活跃,细胞增多呈漩涡状紧密排列,细胞集落密集；5×104组:镜下观察LIPUS组于照射后1d、3d细胞分裂增殖较空白对照组活跃,细胞集落密集,照射5d后两组细胞集落密集程度相似。MTT检测示:3×103组:LIPUS组和空白对照组细胞增殖活性在各检测时间比较均无差异性,无统计学意义(P>0.05)；5×103组:LIPUS组和空白对照组细胞增殖活性在0d、5d比较无差异性(P>0.05),1d、3d LIPUS组细胞增殖活性高于空白对照组,有统计学意义(P<0.05)；1×104组:LIPUS组于照射后各检测时间细胞增殖活性明显高于空白对照组(P<0.05)；5×104组:细胞生长较快,MTT检测两组细胞增殖活性无明显差异性(P>0.05)。观察各密度组细胞增殖活性曲线,1×104组BMSCs增殖曲线较稳定,故定为后续研究的最佳铺板密度。
　　 2.形态学观察:LIPUS组于照射后各天细胞分裂增殖较空白对照组明显活跃,细胞集落更为密集；MTT检测表现为:LIPUS组于照射后1d、3d、5d的细胞增殖活性均明显高于空白对照组(P<0.05)；流式细胞仪检测细胞周期显示:LIPUS组于照射后各天的细胞增殖率(S+G2％)均明显高于空白对照组(P<0.05)；LIPUS组的细胞增殖率最高可高出空白对照组113.2％,最低为21.1％,LIPUS组增殖率平均要高出空白对照组40.9％。
　　 3.形态学观察显示:两组细胞形态宽大、扁平,透光性增强,LIPUS组于照射后细胞生长较空白对照组活跃,覆盖板底面积较空白对照组大；MTT显示LIPUS组于照射后在各检测时间细胞增殖活性明显高于空白对照组(P<0.05)；流式细胞仪检测示:LIPUS组于照射后1d、3d、5d细胞增殖率显著高于空白对照组(P<0.05)
　　 4.在不同培养体系下,LIPUS组Bmi-1基因mRNA表达均高于空白对照组(P<0.05)；正常培养条件下LIPUS组Bmi-1基因mRNA表达明显高于低血清培养状态下LIPUS组和原代BMSCs(P<0.05),低血清培养状态下LIPUS组的Bmi-1基因mRNA表达亦高于原代BMSCs(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1.细胞接种密度为1×104个/ml更便于长时间的研究和观察。
　　 2.提示LIPUS对BMSCs增殖具有促进作用,并能有效地促进静止期的BMSCs进入分裂期。
　　 3.LIPUS对低血清培养体系下的BMSCs的增殖也具有显著的促进作用。
　　 4.LIPUS可能通过调控Bmi-1基因的表达从而达到促进BMSCs增殖的作用。