国产水溶性蜂胶对主要致龋链球菌及其耐氟菌株致龋性的影响

摘要

　　 龋病是一种慢性非传染性疾病，是人类的常见病及多发病之一，严重影响着人们的健康。龋病是在以细菌为主的多因素影响下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病，细菌是龋病发生的最关键因素，其中变形链球菌（S.mutans）血清c型和远缘链球菌（S.sobrinus）血清g型是与人类龋病密切相关的重要致龋菌。葡糖基转移酶（GTF）在口腔细菌粘附和牙菌斑形成的过程中起重要作用，是变形链球菌群致龋的主要毒力因子之一，是细菌致龋的必备条件和物质基础。
　　 目前龋病的防治研究主要围绕链球菌在牙面的粘附、聚集及增殖等几个环节进行，其中细菌增殖方面的防龋研究主要集中在抗菌制剂抑制细菌生长方面，葡糖基转移酶在细菌粘附方面起重要作用。国内外已经有大量有关防龋药物的研究。其中氟的防龋效果已经得到研究证实，但是氟化物的广泛应用，使其产生一些致龋的耐氟菌株，增加了防龋难度。因此寻求新的安全有效的防龋药物成为研究的热点。
　　 蜂胶（propolis）是一种具有粘性和芳香性的固体胶状物质，具有广泛的生物学活性和药理学作用，有研究已证实蜂胶对口腔常见致病菌有较强的抑制作用。尽管国内外对蜂胶做了大量的研究，但是目前还没有关于蜂胶对主要致龋链球菌耐氟菌株的生长抑制作用及对GTF酶活性影响等相关的研究报道；且蜂胶来源、产地及提取工艺不同，在其成分及抗菌活性上会有所差别。因此本实验选择了国产水溶性蜂胶，测定国产水溶性蜂胶对变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株的生长抑制作用、葡糖基转移酶的活性影响。
　　 目的：
　　 本研究将借鉴国内、外研究成果，测定国产水溶性蜂胶对主要致龋链球菌亲代菌株及其耐氟菌株的生长抑制作用、葡糖基转移酶（GTF）活性的影响，进一步证实蜂胶作为天然药物防龋的有效性，并为国产蜂胶的开发利用提供一定的理论依据。
　　 材料与方法：
　　 1.氟化钠最小抑菌浓度（MIC）递增法体外诱导耐氟菌株。
　　 将冻干保存的菌种变形链球菌（S.m）和远缘链球菌（S.s）接种于BHI血琼脂培养基中，37℃微需氧活化培养48h（900ml/L N2，100ml/LCO2），经革兰染色镜检及生化鉴定为变形链球菌和远缘链球菌纯培养后，采用液体稀释法测定对氟化钠的敏感性。
　　 取S.m和S.s单菌落接种于TSA上37℃微需氧活化培养48h，刮取菌苔涂布于含NaF的TSA上，其氟化钠含量分别为600、650、700、750、800、850、900、950、1000mg/L（S.m）；300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000mg/L（S.s），逐步诱导产生耐氟菌株。将其在不含NaF的TSA上连续传代20次后，再接种于含1000 mg/L NaF的TSA上37℃培养，产生S.m和S.s耐氟菌株（S.m-FR、S.s-FR）。进行革兰染色镜检及生化鉴定后，冷冻保存。
　　 2.蜂胶对变形链球菌、远缘链球菌及其耐氟菌株的体外抑菌实验。
　　 将过滤除菌的100g/L的蜂胶溶液配制成25g/L的蜂胶TSA液，采用倍比稀释法将蜂胶配制成不同的浓度，最高浓度为25g/L，最低浓度为0.10g/L，共9个浓度，每支试管分装成1ml；采用麦氏比浊法用TSA液体培养基将4种细菌配成细菌混悬液1.5×106 CFU/ml，分别取0.05 ml菌液加入1ml含不同浓度蜂胶的TSA中，37℃微需氧活化培养48h（900ml/L N2，100 ml/L CO2），观察结果，实验管呈现澄明，摇匀后仍澄明者，认为该管无菌生长，从无菌生长的各管中找出最低药物浓度的实验管，该管的药物浓度即为最小抑菌浓度（MIC）。然后，将未见细菌生长的各管培养物各取一接种环涂布在TSA琼脂培养基中，37℃微需氧活化培养48h（900ml/L N2，100 ml/L CO2），平板上无菌落生长的最小稀释度的药物浓度即为最小杀菌浓度（MBC）。每一菌株的测定均重复3次，取MIC、MBC均值。设立阴性对照组和阳性对照组。
　　 3.蜂胶对S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR葡糖基转移酶的影响。
　　 将100g/L的蜂胶溶液用双蒸水将其稀释成6.25、3.13、1.56、0.78、0.39g/L共5个浓度以备用。将冷冻保存的菌种S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR微需氧活化培养48h经鉴定后，采用麦氏比浊法将4种细菌配成1.5×108CFU/ml，各取5 ml菌液分别接种于50ml含10g/L蔗糖的TSB液体培养液中，37℃微需氧活化培养18h（900ml/L N2，100 ml/L CO2）。将上述细菌培养物离心（3300×g，20min，4℃），收集上清液，加入固体硫酸铵达60％饱和度，置4℃冰箱过夜，离心（10000×g，30min，4℃）后收集沉淀，将沉淀溶于含0.01％NaNO3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.4）后用相同缓冲液透析48h，每12小时换1次液体，聚乙二醇（相对分子质量100000）浓缩至5ml得GTF粗酶。取粗制酶液0.05ml，0.1ml0.5mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.0），0.1ml0.5mol/L蔗糖，0.4ml双蒸水，以及不同浓度的蜂胶溶液0.05ml，37℃孵育1h，加0.1ml0.24mol/L HCL终止反应，再加2.5ml双蒸水混匀，离心2000×g，5min，上清液的还原糖用Neson-Somogyi法测定。以空白管调零，于波长为620nm处读取光密度值[D（620）]。实验共分7组，即5个不同浓度的实验组和2个对照组，每组6个平行管，每管测定3次，结果取其均值。设立阴性对照组和阳性对照组。
　　 结果：
　　 1.所获得的耐氟菌株在不含NaF的TSA上连续传代20次后，仍可以在含1000 mg/L NaF的TSA培养基中生长，其显微镜下菌体形态较亲代菌株稍膨大，生化反应：S.m，S.m-FR甘露醇、山梨醇、棉子糖、密二糖为阳性反应，精氨酸为阴性反应；S.s，S.s-FR甘露醇、山梨醇为阳性反应，棉子糖、密二糖、精氨酸为阴性反应，只是耐氟菌株比亲代菌株阳性出现时间晚。
　　 2.水溶性蜂胶对S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR最小抑菌浓度（MIC）分别为0.39 g/L、0.78 g/L、0.20 g/L、0.39g/L；最小杀菌浓度（MBC）分别为0.78 g/L、1.56 g/L、1.56 g/L、1.56g/L。
　　 3.6.25g/L、3.13 g/L、1.56g/L、0.78 g/L、0.39g/L的蜂胶对S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR的GTF均有抑制作用，各蜂胶浓度组与阳性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），6.25、3.13 g/L和1.56 g/L3组与0.78、0.39 g/L2组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：
　　 1.在蜂胶浓度为0.78g/L时，能完全抑制变形链球菌、远缘链球菌及其耐氟菌株的生长；在蜂胶浓度为1.56g/L时，能完全杀灭变形链球菌、远缘链球菌及其耐氟菌株。
　　 2.在出现耐氟菌株时，国产水溶性蜂胶能将其抑制或杀灭，这提示国产水溶性蜂胶可有效抑制或杀灭变形链球菌和远缘链球菌及其耐氟菌株。
　　 3.国产水溶性蜂胶对GTF活性有一定的抑制作用，随着蜂胶浓度升高，S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR4种菌的GTF活性逐渐降低，但当浓度达1.56g/L时，抑制GTF活性的作用不再增强。
　　 4.国产水溶性蜂胶在预防龋病方面具有一定的研究价值。