巨噬细胞游走抑制因子在复杂性区域疼痛综合征1型大鼠中的表达及意义

摘要

第一部分:复杂性区域疼痛综合征1型两种大鼠造模方法的比较
　　背景：复杂区域疼痛综合症(Complex regional pain syndrome，CRPS)1型是以肢体痛觉异常为主要表现，涉及皮肤、血管、神经、肌肉和骨关节等多系统损害的风湿性疾病，临床症状复杂，缺乏有效治疗手段，多数病人长期忍受慢性疼痛并最终丧失劳动力。尽管几十年来学者不断提出各种假说，但至今CRPS1型的病理机制仍不明确，相关研究进展缓慢。直到2004年CRPS1型大鼠模型的建立大大促进了CRPS1型的基础研究。目前Pubmed检索到与CRPS1型大鼠实验相关的文献主要采用的是两种模型：大鼠骨折制动后慢性痛(PFCP)模型及缺血加压所致慢性缺血后疼痛(CPIP)模型。我们采用这两种模型的方法分别进行大鼠造模，探讨两种不同造模方法的区别，为实验选择合适的大鼠造模方法提供参考依据。
　　目的:比较两种复杂性区域疼痛综合征1型的大鼠造模方法的特点，分析两种造模后大鼠的局部表现、疼痛行为、皮肤及神经组织结构改变、皮肤微循环以及血清P物质(SP)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化。
　　方法：成年SD健康大鼠32只，随机分为正常对照组、假手术组，骨折制动组及缺血加压组，每组8只。所有大鼠造模前采血及测定疼痛阈值基线。假手术组给予石膏固定。骨折制动组采用胫骨骨折弹力绷带制动石膏固定模型，缺血加压组给以O形橡胶圈加压模型分别造模。分别在造模结束后的第8h、24h、48h、4天、1周、2周、4周时测定疼痛行为。并于造模结束后的第8h、1周、2周、4周采血测定SP、TNF-α的表达。4周时微循环检测、取皮肤及坐骨神经HE染色光镜下观察病理组织改变。
　　结果：骨折制动组有3只出现断肢，所剩5只造模8h后均出现疼痛阈值下降。缺血加压组造模后大鼠均出现自发痛、痛觉过敏(疼痛阈值下降)及痛觉超敏(Q-tip阳性)改变，但症状波动较骨折制动组更为明显。TNF-α及SP血清水平变化在两造模组基本同步，在造模结束时表达均显著高于正常对照组(P<0.05-0.01)。与正常对照组比较，骨折制动组与缺血加压组均有明显的皮肤微循环改变，以骨折制动组更为明显。两组大鼠皮肤及坐骨神经HE染色光镜下结构无明显异常，骨折制动组部分可见小溃疡样改变及坐骨神经纤维轻度水肿。
　　结论：骨折后制动造模与缺血加压造模方法均可造成与复杂性局域疼痛综合征1型相似的症状及病理改变。缺血加压组症状波动大，以急性早期CRPS1表现为主，而骨折制动模型的症状及病理改变更为持续，可模拟早中期CRPS1的表现。
　　第二部分：巨噬细胞游走抑制因子在复杂性区域疼痛综合征1型大鼠骨折模型中的表达
　　背景：复杂性区域疼痛综合征可因轻微的外伤、小手术诱发，表现为与刺激不成比例的慢性肢体疼痛及痛觉过敏，并伴随局部皮肤、骨关节及交感神经功能紊乱等一系列症状，其病理机制尚不清楚。自1942年Sudeck首次提出肢体局部炎症反应可能是CRPS1的主要发病原因之后，越来越多的证据说明CRPS1型的发生和维持与免疫炎症关系密切。但对于CRPS1型的炎症是局部、还是全身性反应至今仍存在质疑，已找到的炎症因子临床意义亦不明确。因此寻找到具有诊治意义的CRPSl型关键性炎症因子是当前CRPS1研究的突破点。
　　巨噬细胞游走抑制因子(MIF)作为重要的促炎因子在免疫相关性疾病中越来越受到重视，同时其作为神经调节因子在神经损伤及再生中的作用以及在疼痛发生及维持中的作用也逐渐被认识。我们认为具有神经及免疫双重调节作用的促炎因子MIF很可能为CPRS1型的关键性炎症因子，成为CRPS治疗的新靶点。
　　目的：探讨巨噬细胞游走抑制因子在复杂性区域疼痛综合征1型大鼠骨折模型的血清、脑脊液、皮肤、坐骨神经、脊髓的表达变化。
　　方法：32只成年雄性SD大鼠，随机分4组：正常对照组、假手术组、骨折对照组及模型组，每组8只。造模结束后，检测各项指标后处死。造模前后检测大鼠后足疼痛行为。造模成功后的分别采用ELISA、Western blot、免疫组化方法分别测定MIF在各组大鼠的血清、脑脊液、皮肤、脊髓、坐骨神经的表达。
　　结果：ELISA检测显示MIF在CRPS1模型组大鼠的血清、脑脊液及皮肤、坐骨神经、脊髓的表达均显著上调(与各对照组比较，P<0.05-0.01)。Western blot显示皮肤、坐骨神经、脊髓的MIF表达显著高于各对照组(P<0.05)。免疫组化显示MIF在模型组皮肤及坐骨神经强表达而在各对照组均为弱表达或无表达。
　　结论：MIF在CRPS1型各部位均表达上调，提示其可能广泛参与了CRPS1型的病理过程。
　　第三部分:靶向抑制巨噬细胞游走抑制因子在复杂性区域疼痛综合征1型大鼠骨折模型中的作用
　　背景：复杂性区域疼痛综合征(CRPS)1型在骨折或卒中后发病率可高达35％～64％，其病理机制仍不明确，迄今尚无统一的发病机制及治疗模式。因缺乏有效治疗手段，多数患者长期忍受慢性疼痛并最终致残。仅有少量药物可用于CRPS1型，而糖皮质激素是目前唯一有证据能改善早中期CRPS1型患者预后(Grade1A)的药物，但需长期大剂量服用。激素的副作用以及CRPS1型本身存在的骨质疏松限制了其临床应用。随着免疫学的发展，研究发现免疫细胞介导的炎症反应及炎症因子的释放参与了CRPS1型的发病，有证据表明炎症因子靶向阻断药物在CRPS1型治疗中可能有效。
　　巨噬细胞游走抑制因子(MIF)是炎症反应不可缺少的促炎因子，目前已被作为多种疾病炎症活动的生物标志物及治疗靶点而备受关注。已证实化合物S，R-3-4-羟苯-4，5-二氢-5-异噁唑乙酸甲酯又称ISO-1可通过靶向阻断MIF互变异构酶活性抑制MIF促炎的生物作用，达到抗炎作用。在上一章我们已通过ELISA、蛋白质印迹、免疫组化等方法证实MIF在CRPS1型大鼠血、脑脊液、皮肤、坐骨神经及脊髓中的表达上调，提示MIF可能广泛参与CRPS1型的病理改变。我们拟进一步探讨靶向抑制MIF在CRPS1型中的作用，证实MIF在CRPS1型中的病理作用，并为CRPS1型治疗提供新的治疗靶点。
　　目的：与糖皮质激素比较，探讨靶向抑制MIF对CRPS1型大鼠的治疗作用。
　　方法：成年雄性SD大鼠，随机分9组：激素治疗1组(n=7)进行骨折制动造模结束后以甲强龙1 mg/(kg·d)溶解于5％二甲基亚砜(DMSO)10 ul肌肉注射；激素治疗2组(n=7)以甲强龙10mg/(kg·d)溶解于5％DMSO10 ul肌肉注射；靶向治疗1组(n=7)进行骨折制动造模结束后给以MIF抑制剂ISO-1以0.1 mg/(kg·d)溶解于5％DMSO10 ul中稀释后行皮下注射，连续14 d；靶向治疗2组(n=7)以ISO-11 mN(kg·d)；联合治疗1组(n=7)进行骨折制动造模结束后以ISO-10.1mN(kg·d)及甲强龙1mg/(kg·d)；联合治疗2组(n=7)进行骨折制动造模结束后以ISO-10.1mNg/(kg·d)及甲强龙10mg/(kg·d)；模型对照组(n=7)，骨折制动造模给以皮下注射5％DMSO10 ul；假手术组(n=5)给以石膏假固定，并皮下注射5％DMSO10 ul；正常对照组(n=5)给以皮下注射5％：DMSO10 ul；连续治疗2周。治疗前后检测动物疼痛行为，治疗结束后第8h、1周、2周检测血清MIF、SP水平，第2周时观察各组大鼠患肢皮肤微循环。
　　结果：
　　(1)各治疗组治疗结束后的2周观察期内，大鼠肢体肿胀均轻于模型对照组(P<0.05)。各治疗组血清SP均明显低于模型对照组(P<0.05-0.01)。
　　(2)治疗结束后第8h及第一周，除激素治疗1组疼痛阈值与模型组无统计学差异外，其他治疗组的疼痛阈值均明显高于模型对照组(P<0.05)。治疗结束后的整个观察周期，ISO-1治疗2组疼痛阈值始终高于ISO-1治疗1组(P<0.05)。
　　(3)除激素治疗1组及靶向治疗1组血清MIF水平与模型对照组无统计学差异(P>0.05)外，激素治疗2组、靶向治疗2组及联合治疗组血清MIF均明显低于模型对照组(P<0.05)。
　　(4)ISO-1治疗2组及联合治疗组的患肢微循环障碍积分明显低于模型对照组及其他治疗组(P<0.05)。
　　结论：
　　(1)MIF抑制剂ISO-1可显著改善CRPS-1大鼠肢体肿胀、疼痛及局部微循环，并呈剂量依赖性。提示MIF参与了大鼠肢体肿胀、疼痛、微循环障碍的病理过程，靶向抑制MIF是治疗CRPS1型的有效手段。
　　(2)激素可有效抑制MIF表达，达到抗炎镇痛作用，但需要大剂量才见效，小剂量激素对大鼠肢体疼痛症状无影响。
　　(3)ISO-1抗炎镇痛作用与大剂量激素相当，但在改善微循环方面有优势。
　　(4)ISO-1具有“激素节省剂”作用，可与小剂量糖皮质激素联合用于CRPS-1的治疗，有效抑制MIF分泌，改善大鼠肢体肿胀、疼痛及微循环。