CXCR4-siRNA重组腺病毒载体的构建及其沉默CXCR4基因的体外研究

摘要

第一部分应用AdMax载体系统构建CXCR4-si RNA重组腺病毒载体
　　目的：应用AdMax载体系统构建CXCR4-siRNA重组腺病毒载体，为研究其对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响奠定基础。
　　方法：将CXCR4基因的小干扰片段克隆至腺病毒穿梭质粒PAVsi1.1，通过PCR和测序筛选阳性克隆，将重组穿梭质粒、腺病毒辅助包装质粒、3Cre共转染HEK293细胞，包装产生CXCR4-siRNA重组腺病毒载体。在HEK293细胞中大量包装扩增病毒，收集病毒液，测定病毒滴度。
　　结果：PCR和测序结果均提示CXCRL4基因的小干扰片段成功构建至腺病毒穿梭质粒，通过HEK293反复包装扩增后，在荧光显微镜下可观察到HEK293细胞中绿色荧光蛋白的大量表达，病毒滴度为6×108PFU/ml。
　　结论：AdMax载体系统可成功构建CXCR4-siRNA重组腺病毒载体。
　　第二部分 CXCR4-siRNA重组腺病毒载体沉默人卵巢癌细胞株CXCR4基因表达的研究
　　目的：研究CXCR4-siRNA重组腺病毒载体对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响。
　　方法：将收集的大量病毒液转染人卵巢癌细胞株SKOV3。细胞分为三组：siRNA组，转染空病毒载体的阴性对照组，细胞不做任何处理的空白对照组。通过PCR、Western blot、免疫组化检测CXCR4基因沉默效果。
　　结果：病毒转染至SKOV3细胞后，在荧光显微镜下可观察到SKOV3细胞中绿色荧光蛋白的大量表达，重组腺病毒能够有效抑制SKOV3细胞中CXCR4的表达。
　　结论：CXCR4-siRNA重组腺病毒载体可高效转染靶细胞和沉默CXCR4基因的表达，为RNA干扰技术应用于卵巢癌的临床基因治疗奠定基础。