肝细胞癌Wnt信号通路抑制因子Wif-1基因启动子甲基化状态的基础与临床研究

摘要

WNT信号传导通路在有机体生长发育与肿瘤发生发展各个环节都有着广泛涉及。目前诸多研究表明WNT通路的开启归因于其下游靶基因，如GSK-3β，C-myc，Cycline D1，axin，ngn1等的突变或者缺失。然而对于WNT信号传导通路的上游信号，如、WNT蛋白及其抑制物(Wif-1，WNT2，WNT3等)的基因异常改变及其表观遗传改变却研究相对较少。在肝细胞癌中WNT蛋白表达相比于正常肝组织明显减少。提示肝癌的发生及其进展都与WNT信号传导通路中基因的上调或下调有着密不可分的关系。此外WNT信号通路的下游因子β-catenin蛋白异质表达亦是WNT信号传导通路的一至关重要的因素。同时有研究表明，WNT通路下游靶基因C-myc，Cycline D1亦有所增加。究竟β-catenin蛋白异质表达与C-myc，Cycline D1还是Wif-1更相关却鲜有报道。Wif-1(Wnt inhibitory factor-1)是WNT信号抑制物之一，其与WNT蛋白相结合从而阻断WNT信号转导通路。肝细胞癌的Wif-1下调，但其机制及其生物学效应上不太清楚。
　　目的：
　　(1)检测Wnt通路Wif-1、C-myc及Cycling-D1基因在正常肝细胞和肝癌细胞中的表达。探讨上游因子Wif-1、下游靶基因C-myc及Cycling-D1与β-catenin异质表达的相关性。
　　(2)检测普鲁卡因或5-aza-dc作用于肝癌细胞株HepG2后逆转Wnt通路抑制因子Wif-1的甲基化状态。
　　(3)研究普鲁卡因与顺铂单独或者共同作用于肝癌细胞株HepG2的增抗殖活性。探讨运用这两种药物是否具有协同作用。
　　方法：
　　(1)运用免疫组化与原位杂交检测35例肝癌组织中Wif-1、C-myc及Cycling-D1基因的表达，并用35例正常肝组织作为对照。
　　(2)分别运用普鲁卡因和5-aza-dc药物干预后，通过RT-PCR法、巢式甲基化特异性PCR法及Western Blot法检测wif-1的表达情况。
　　(3)RT-PCR法，MTT法和Western Blot法检测普鲁卡因与顺铂作用于肝癌细胞株HePG2Wif-1启动子脱甲基化改变，普鲁卡因是否改变化疗药顺铂的药敏性。
　　结果：
　　(1)肝细胞癌组织与正常肝组织Wif-1(Pearson相关系数r免=0.53，r原=0.50)、C-myc(Pearson相关系数r免=0.48，r原=0.48)及Cycling-D1(Pearson相关系数r免=0.47，r原=0.44)蛋白和mRNA表达均与β-catenin蛋白异质表达均与β-catenin异质表达相关(p<0.05)。
　　(2)普鲁卡因处理的实验组甲基化率(14.41％)较5-aza-cdr处理的对照组(29.29％)明显降低。
　　(3)用RT-PCR方法与Western Blot法检测实验组与对照组Wif-1基因mRNA及蛋白表达均较未经任药物处理组有显著性差异(P<0.01)；实验组较LO正常细胞组无显著性差异(P>0.05)。
　　(4)经普鲁卡因处理过的HePG2细胞组的WIF基因mRNA水平、脱甲基化水平及Wif-1蛋白表达水平均较未经任药物处理的HePG2细胞组有显著性差异(P<0.01)；顺铂处理的HePG2细胞WIF基因mRNA、脱甲基化及Wif-1蛋白均无表达；经普鲁卡因或顺铂单独处理过的HePG2细胞株的抗增殖活性均增强；普鲁卡因能增强化疗药顺铂的药敏性。
　　结论：
　　(1)在Wnt信号通路中上游因子Wif-1比下游靶基因C-myc、Cycling-D1与β-catenin异质表达的相关性大。
　　(2)Wif-1基因启动子甲基化状态可作为诊断肝细胞癌的一个重要分子标志物。普鲁卡因对其脱甲基化的作用较5-azaβdc脱程度高。
　　(3)肝细胞癌Wnt信号通路中普鲁卡因具有脱甲基化的作用，并且能增强顺铂的药敏性。