转化缺失的无荚膜肺炎链球菌作为活疫苗候选菌株的安全性及保护效果评价研究

摘要

目的：
　　 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）是一种定植于人体上呼吸道的主要病原体，能够引起危及生命的肺炎、败血症、脑膜炎以及像鼻窦炎、中耳炎等常见性疾病。鉴于目前肺炎链球菌耐药菌株的大量增加，研制安全性高、保护效果好的疫苗是遏制肺炎链球菌感染的迫切需要。
　　 肺炎链球菌多糖疫苗(PPV)及结合疫苗(PCV)存在生产成本高、菌株类型覆盖有限、血清型置换等弊端，于是本研究着眼于血清型非依赖的减毒活菌疫苗的研发。本课题通过缺失肺炎链球菌转化关键基因comE获得转化缺陷株，这类菌株失去获得外源基因的能力，因此不易发生毒力回复。在此基础上我们构建了转化缺陷的无荚膜菌株，对其进行安全性、保护效果方面的研究，评价其作为减毒活疫苗的可行性。
　　 方法：
　　 通过基因替代失活的方式获得缺陷菌D39△cps、R6△comE、D39△cps△comE并进行基因测序及计算体外转化率来鉴定。安全性通过以下方面评价:不同剂量攻毒小鼠进行生存率实验;攻毒后采集并培养小鼠心脏血、鼻腔灌洗液、肺匀浆及脑匀浆观察细菌定植情况;感染肺炎链球菌小鼠的肺部组织形态学观察。保护效果通过以下方面评价:活菌疫苗鼻腔免疫小鼠后，D39强毒株攻毒观察小鼠生存率;19F感染后观察小鼠鼻咽部及肺部细菌载量;通过ELISA法检测血清特异性抗体IgG及其亚型效价、细胞因子IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ水平。
　　 结果：
　　 成功构建了缺陷菌R6△comE、D39△cps△comE，外源基因整合率实验中转化缺陷菌R6△comE、D39△cps△comE转化率均为零，而R6、D39△cps转化率在1.4％～2.4％之间。
　　 鼻腔感染野生D39的小鼠组，平均生存时间为1.5天;而感染D39△cps、D39△cps△comE、R6、R6△comE的小鼠，均可完全存活，生存率为100％,且在血和脑中未检测到细菌，其鼻腔灌洗液和肺部定植量均显著低于阳性对照D39组。此外，在小鼠的血液和脑匀浆中均无定植，表明这4株菌不侵入血液，不入脑。通过鼻腔感染后不同时间点肺部组织切片的观察，发现comE缺陷菌株的肺部炎症要轻于对应野生菌，并且72h后感染这4株菌的小鼠肺部炎症均基本恢复。
　　 粘膜免疫小鼠后，四组实验组均可产生高效价的血清IgG（IgG1、IgG2b为主）;与佐剂对照组相比，细菌刺激免疫组小鼠脾细胞均可产生较高水平的特异性IL-4、IL-10以及IL-17;四组疫苗均可显著降低19F在鼻咽部及肺部定植;R6、R6△comE、D39△cps、D39△cps△comE四组疫苗对致死性D39感染的保护效果分别为60％、70％、70％、50％。
　　 结论：
　　 无荚膜的R6、D39△cps以及转化缺陷株R6△comE、D39△cps△comE不会使BALB/c小鼠致病。转化缺陷菌株与野生菌株粘膜免疫均能够有效刺激机体的体液和细胞免疫反应，有效抵D39强毒株的侵袭性感染和定植，保护效果之间无显著性的差异。结果表明，转化缺陷不影响活菌疫苗的保护效果，但可使细菌不能获取外源基因而恢复毒力，安全性得到提高。该研究为研发安全性高的活菌疫苗提供了一个新的思路。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 转化缺失的无荚膜肺炎链球菌的构建和鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 转化缺失的无荚膜肺炎链球菌的安全性评价

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 转化缺失的无荚膜肺炎链球菌的保护效果评价

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 肺炎链球菌全菌疫苗的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录