IGF-1：一种潜在的抗癫痫发作新靶标

摘要

第一部分IGF-1在颞叶癫痫患者及点燃大鼠脑组织中的表达
　　目的：研究IGF-1在难治性颞叶癫痫（TLE）患者颞叶皮质中的表达，及IGF-1在化学点燃模型即匹罗卡品（PILO）诱导颞叶癫痫模型和戊四氮（PTZ）急性点燃模型海马脑组织中的动态表达规律。
　　方法：人脑组织标本源自课题组的癫痫脑库，从中随机抽取24例难治性 TLE患者颞皮质标本，12例对照组标本。酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）用于检测检测IGF-1蛋白表达，荧光定量PCR（quantitative real time PCR,qRT-PCR）技术检测IGF-1 mRNA表达水平。用ELISA和qRT-PCR检测成年雄性SD大鼠IGF-1表达，动物随机分为正常对照组（n=5）和癫痫组（SE后6h组、24h组、7d组、21d组、60d组,各组n=5），经腹腔注射PILO诱导癫痫持续状态（status epilepticus,SE），构建SE后颞叶癫痫动物模型。用PTZ大鼠急性点燃模型验证急性期IGF-1的表达，分6h组（n=5）和24h组（n=5）。
　　结果：IGF-1 mRNA及蛋白在TLE患者颞叶皮质中的表达较非癫痫对照组颞叶皮质表达水平明显增高，IGF-1 mRNA表达的相对量对照组为1.19±0.34，TLE组为2.46±1.48；IGF-1蛋白对照组为235.75±50.54 pg/mg，TLE组为311.58±101.79 pg/mg，（P＜0.05）。PILO模型鼠IGF-1 mRNA相对水平在SE后24h、21d和60d三个时间点的表达显著增高，对照组均值为1.03±0.05，24h组为2.15±0.46，21d组为2.69±0.55，60d组为3.57±0.64，差异有统计学意义（P＜0.05）；ELISA结果显示IGF-1蛋白水平在PILO模型癫痫急性期（SE后6h和24h）和SRS后（SE后21d和60d）IGF-1蛋白水平表达均显著增高（P＜0.05）；对照组为9.16±0.83，SE后6h组16.04±2.24，24h组19.98±2.18，21d组13.41±2.28，60d组为13.26±1.9（ng/mg蛋白）；PTZ模型GTCS6h和24h后IGF-1蛋白表达水平也显著增高（P＜0.05），分别为14.05±2.03和13.96±3.58（ng/mg蛋白）。
　　结论：在颞叶癫痫患者和动物模型脑组织中 IGF-1表达均明显增加，SE后IGF-1基因和蛋白的高表达可能参与了癫痫的发生发展过程。
　　第二部分癫痫研究新发现：IGF-1及其受体信号通路调控癫痫活动
　　目的：通过大鼠活体侧脑室注射重组人胰岛素样生长因子（rhIGF-1），腹腔注射特异性IGF-1受体抑制剂（picropodophyllin, PPP），观察其对PILO和PTZ模型鼠癫痫活动的影响。大鼠活体给予IGF-1受体下游信号通路MAPK-ERK抑制剂U0126和PI3K-AKT抑制剂LY294002，分别观察其对PTZ模型鼠癫痫活动的影响。
　　方法：所有动物麻醉后经立体定位侧脑室埋置微量注射导管，术后恢复一周，动物在清醒自由活动状态下药物干预，造模后观察大鼠行为学变化。分组：对照组（n=13），侧脑室注射等量生理盐水；IGF-1组（n=13），侧脑室注射rhIGF-110μg；PPP组（n=15），侧脑室注射（NS），腹腔注射PPP20mg/kg体重；干预后1h分别腹腔注射PILO诱导SE。PTZ模型采用同样的分组及干预方法（各组n=10）。PILO模型观察SE潜伏期，4级以上SE发作比率，最大发作评分（Racine score）和急性期死亡率。PTZ模型观察惊厥发作潜伏期和发作比率。两组均记录脑电活动（n=3）。IGF-1下游信号干预分为对照组，U0126组（5μΜ,i.c.v.）， LY294002组（20μΜ,i.c.v.），U0126+ LY294002组（U01265μM+LY29400220μM,i.c.v.）（各组n=10）。干预后1h分别腹腔注射PTZ造模，观察惊厥发作潜伏期和发作比率。
　　结果：PILO模型对照组SE潜伏期均值为28.89±7.96(min)，IGF-1组为19.58±8.05(min)，PPP组为38.63±13.06(min)；用ANOVA多种样本均数间比较显示与对照组比较，IGF-1组潜伏期明显缩短，PPP组潜伏期明显延长（P＜0.05）。大鼠IV级以上发作比率显示：对照组为9/12，IGF-1组为12/13，PPP组为8/15，IGF-1组和PPP组比较有显著统计学差异。对照组最大发作评分3.38±1.94，IGF-1组为4.46±1.27， PPP组为2.53±2.0；大鼠急性期死亡率为IGF-1组30.77（4/13），对照组7.69％（1/13），PPP组没有大鼠死亡，IGF-1组和PPP组比较有显著统计学差异（P＜0.05）。
　　PTZ模型对照组GTCS发病潜伏期均值为107.5±5.04(s)，IGF-1组为86.9±6.08(s)，PPP组为124.17±13.21(s)，IGF-1+ PPP组为116.63±11.44(s)，与对照组比较，IGF-1组潜伏期明显缩短，PPP组潜伏期明显延长（P＜0.05）。GTCS发病比率IGF-1+PPP组为8/10，PPP组（6/10）与对照组（10/10）和IGF-1组（10/10）比较有显著统计学差异（P＜0.05）。
　　PTZ模型IGF-1受体下游信号通路的活体干预研究显示，对照组GTCS发病潜伏期(s)均值为92.6±8.09，LY294002组为109.5±14.2，U0126组为105.83±8.75，LY294002+U0126组为122.5±16.67；与对照组比较，LY294002组和LY294002+ U0126组潜伏期均明显延长， LY294002+U0126组与LY294002组和U0126组比较潜伏期也显著延长（P＜0.05）。GTCS发病比率对照组为10/10，LY294002组为8/10、U0126组和LY294002+U0126组均为6/10；U0126组和LY294002+U0126组与对照组比较均有显著统计学差异（P＜0.05）。
　　结论：IGF-1增加PILO诱导SE发作比率，缩短潜伏期，增加最大发作评分和死亡率，缩短PTZ模型GTCS潜伏期，说明IGF-1增加可能有增加癫痫发作敏感性和SE严重程度的作用。PPP延长PILO诱导SE潜伏期，减少SE发作比率，降低SE评分和急性期大鼠死亡率；PPP，U0126和LY294002在延长PTZ模型GTCS潜伏期，减少GTCS发作比率方面都有一定效果；说明抑制 IGF-1受体和下游信号通路可能有抑制癫痫活动的效果。
　　第三部分IGF-1及其受体信号通路在癫痫发作中的细胞与分子机制
　　目的：通过离体海马脑片IGF-1和PPP干预行膜片钳技术研究二者对癫痫模型海马兴奋性的影响，应用分子生物学技术检测IGF-1受体及下游信号活化状态，探讨IGF-1受体及其下游信号通路参与癫痫活动的分子机制。
　　方法：用出生后14～16天乳鼠构建离体海马脑片，无镁诱导癫痫模型（对照组），IGF-1和PPP干预组（各组N=8-12），均记录场电位（fEPSP）轨迹，分析fEPSP斜率，记录无镁诱导痫样放电频率。观察微小兴奋性突触后电流（mEPSC）和兴奋性突触后电流（EPSC），包括：AMPAR和NMDAR介导的EPSC。IGF-1组在无镁人工脑脊液及记录液中加入IGF-1100ng/ml30min后记录，PPP组无镁诱导前加PPP5μM孵育1-2h，再给予无镁诱导，同时加IGF-1处理。用Western blot技术检测LiCL-PILO模型，正常对照、SE后6h组、24h组、7d组、21d组和60d组海马pIGF-1R/IGF-1R、pERK1/2/ERK1/2及pAKT/AKT蛋白水平的变化；检测IGF-1和PPP干预后6h和24h pIGF-1R/IGF-1R、pERK1/2/ERK1/2及pAKT/AKT蛋白水平的变化。
　　结果：IGF-1诱导大鼠海马脑片fEPSP斜率增加，增加无镁诱导痫样放电频率（P＜0.05）；PPP预处理，降低IGF-1诱导的fEPSP斜率增加，并减少无镁诱导痫样放电频率（P＜0.05）。与对照组比较，IGF-1增加mEPSC频率，PPP降低IGF-1诱导的mEPSC频率增加。mEPSC振幅累积分布曲线显示：和对照组组比较IGF-1组大鼠海马脑片mEPSC振幅累积分布曲线有显著偏移现象。IGF-1增加AMPAR和NMDAR介导的兴奋性突触后电流幅值，PPP可部分反转IGF-1诱导的EPSC的幅值。与正常对照组比较，PILO模型SE后急性期IGF-1R、ERK1/2及 AKT磷酸化水平增加（P＜0.05）；IGF-1干预进一步增加SE后6h和24hIGF-1R、ERK1/2及 AKT磷酸化水平（P＜0.05），而PPP则有抑制作用（P＜0.05）。
　　结论：IGF-1诱导大鼠海马脑片兴奋性增加，PPP对IGF-1效应有一定的逆转作用，说明IGF-1及其受体通路可能通过兴奋性突触后电位起作用。IGF-1及PPP影响癫痫活动，可能通过IGF-1R及其下游ERK1/2及AKT信号通路的激活来实现的。
　　第四部分miRNA-9调控IGF-1可能是抗癫痫发作新的治疗方法
　　目的：课题组前期miRNAs芯片表达谱研究发现TLE患者颞叶皮质与对照组比较miRNA-9存在差异表达，靶基因预测IGF-1是miRNA-9的靶基因。实验检测TLE与对照组患者颞叶皮质和PILO模型miRNA-9表达，并验证二者的靶标关系。
　　方法：用测定IGF-1 mRNA同批RNA，用 qRT-PCR技术检测miRNA-9表达水平。与广州锐博生物有限公司合作，采用双荧光素酶报告系统验证靶基因。
　　结果：TLE患者颞叶皮质miRNA-9表达较对照组降低，但无显著统计学差异（P>0.05）。PILO模型miRNA-9在SE后6h和7d组较对照组表达显著增高（P<0.05），其它时间点表达差异不模型；双荧光素酶报告系统报告IGF-1是miRNA-9的靶基因。
　　结论：miRNA-9和IGF-1表达在一定程度上有反向关系，结合双荧光素酶报告系统报告IGF-1是miRNA-9的靶基因，我们推测IGF-1可能是miRNA-9靶标，找到调控IGF-1基因新方法，通过miRNA-9调控IGF-1表达可能是一种新的抗癫痫靶标。

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英汉缩略语名词对照

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前言

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第一部分 IGF-1在颞叶癫痫患者及点燃大鼠脑组织中的表达

第一部分 IGF-1在颞叶癫痫患者及点燃大鼠脑组织中的表达

第一部分 IGF-1在颞叶癫痫患者及点燃大鼠脑组织中的表达

第一部分 IGF-1在颞叶癫痫患者及点燃大鼠脑组织中的表达

1材料与方法

1材料与方法

1材料与方法

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2结果

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2结果

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3 讨论

3 讨论

3 讨论

3 讨论

4 小结

4 小结

4 小结

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附 图（一）

附 图（一）

附 图（一）

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第二部分 癫痫研究新发现：IGF-1及其受体信号通路调控癫痫活动

第二部分 癫痫研究新发现：IGF-1及其受体信号通路调控癫痫活动

第二部分 癫痫研究新发现：IGF-1及其受体信号通路调控癫痫活动

第二部分 癫痫研究新发现：IGF-1及其受体信号通路调控癫痫活动

1材料和方法

1材料和方法

1材料和方法

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2结果

2结果

2结果

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3 讨论

3 讨论

3 讨论

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4 小结

4 小结

4 小结

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附 图（二）

附 图（二）

附 图（二）

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第三部分 IGF-1及其受体信号通路在癫痫发作中的细胞与分子机制

第三部分 IGF-1及其受体信号通路在癫痫发作中的细胞与分子机制

第三部分 IGF-1及其受体信号通路在癫痫发作中的细胞与分子机制

第三部分 IGF-1及其受体信号通路在癫痫发作中的细胞与分子机制

1 材料和方法

1 材料和方法

1 材料和方法

1 材料和方法

2结果

2结果

2结果

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3 讨论

3 讨论

3 讨论

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4 小结

4 小结

4 小结

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附 图（三）

附 图（三）

附 图（三）

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第四部分 miRNA-9调控IGF-1可能是抗癫痫发作新的治疗方法

第四部分 miRNA-9调控IGF-1可能是抗癫痫发作新的治疗方法

第四部分 miRNA-9调控IGF-1可能是抗癫痫发作新的治疗方法

第四部分 miRNA-9调控IGF-1可能是抗癫痫发作新的治疗方法

1材料与方法

1材料与方法

1材料与方法

1材料与方法

2 结果

2 结果

2 结果

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3讨论

3讨论

3讨论

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4 小结

4 小结

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全文小结

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参考文献

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文献综述:神经生长因子：抗癫痫发作新靶标

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致谢

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攻读博士学位期间发表的论文

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