沙门菌反向线性探针杂交检测方法的建立及应用

摘要

沙门菌遍布于世界各地，是一种人兽共患病病菌。在世界范围内，沙门菌食物中毒常占首位或第二位。沙门菌感染也是影响实验动物质量和动物实验进程的主要因素之一。随着多重耐药菌株的陆续产生，及时检测出沙门菌，是有效预防沙门菌传播，保证实验动物质量和动物实验顺利进行的关键。因此，开发出一种简便、快速的实验动物沙门菌检测技术具有很大的应用价值。反向线性探针杂交方法(RLPH)能够特异、灵敏地扩增目的基因，具有简便、快速、可靠及造价低等特点，能够满足这一要求。
　　本研究确定了沙门菌的RLPH检测方法，并制备了沙门菌检测试纸条。针对沙门菌特异的argT基因设计了生物素标记上游引物5'端的1对引物，以沙门菌DNA为模板，PCR扩增出496bp大小的片段，在PCR产物序列中选择保守区设计的两条特异性探针，使此PCR产物与探针杂交反应，并对反应条件进行优化。通过优化，设定条件为PCR退火温度为55℃，探针两端添加15C，杂交时间为30 min，洗脱温度为50℃，所加原液抗体为0.4μl。利用设计的1对引物，分别对重庆医科大学检验医学院分离、保藏的沙门菌以及金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示，只有沙门菌PCR扩增结果呈阳性。进一步证明了argT基因的特异性，说明argT基因可以作为检测沙门菌的可靠靶序列。RLPH方法检测灵敏高，PCR产物浓度为3 ng/μl时，可有效检出。与其它常见实验动物致病菌未出现交叉反应。反应结果可通过NBT/BCIP碱性磷酸酶系统显色直接判断。本研究建立的沙门菌RLPH方法具有快速、灵敏、特异、操作简单、设备要求低等特点，不仅可以应用于实验动物的沙门菌检测，同样适用于食品、临床感染沙门菌的检测和诊断，能够满足大批量样本和快速检测的需求。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 沙门菌PCR扩增

1 材料

2 方法

3 结果

4 结论

第二部分 沙门菌RLPH方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 结论

第三部分 沙门菌RLPH方法的应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 结论

全文总结

参考文献

文献综述 实验动物中沙门菌检测方法研究进展

致谢

攻读学位期间撰写和发表论文及参加会议