RP215-VH单域抗体构建表达及活性研究

摘要

目的:
　　利用基因工程技术和生物学方法构建表达RP215-VH重组单域抗体，对其进行免疫活性鉴定及体外抗肿瘤活性的研究，以期为临床提供有潜在价值的抗肿瘤药物。
　　方法:
　　1.从质粒pGEX-RP215-VH切下RP215-VH基因，连接到pET32a(+)，构建出表达质粒pET32a(+)-RP215-VH。
　　2.表达质粒转化BL21(DE3)感受态，IPTG诱导表达，超声破碎大肠杆菌，收集上清，Ni柱纯化，SDS-PAGE及Western-blot鉴定产物。
　　3.利用免疫荧光(immunofluorescence staining，IF)、免疫印迹(Western-blot)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)及竞争酶联免疫吸附试验确定RP215-VH单域抗体对乳腺癌细胞（如MB231、MCF7、BT549、SK-BR-3、MB468）表面的CA215抗原是否有免疫活性。
　　4.通过CCK8细胞毒实验、流式细胞术测定细胞周期及凋亡，分析RP215-VH单域抗体对乳腺癌细胞是否具有体外抗肿瘤生物活性。
　　结果:
　　1.重组质粒基因测序结果是正确的，表明pET32a(+)-RP215-VH质粒成功构建。
　　2.SDS-PAGE及Western-blot鉴定，结果均可见明显约31KD大小目的条带，表明RP215-VH成功表达。
　　3.免疫荧光结果显示，RP215-VH单域抗体在乳腺癌细胞(MB231、MCF7、BT549、SK-BR-3、MB468)中，均可见红色荧光，而在正常乳腺细胞HBL100及PBS空白对照组中均未见红色荧光。
　　4.Western-blot活性鉴定结果显示，在乳腺癌细胞(MB231、MCF7、BT549)，实验组均可见25-75KDa大小的目的条带，0.1％BSA对照组未见条带。
　　5.ELISA活性鉴定实验(MB231、MCF7、BT549、SK-BR-3)结果中，1/25-1/200稀释浓度的实验组OD值均高于空白对照组，数据具有统计学意义(P＜0.05)。
　　6.竞争酶联免疫吸附试验(BT549)中单域抗体稀释比为1/25-1/900时，竞争抑制率分别是53.9％、55.6％、31.4％、10.6％、11.3％、4.6％。
　　7.CCK8细胞毒实验中，在12h时实验组OD值低于空白对照组，但差异未达到统计学意义(P＞0.05)。
　　8.流式测定乳腺癌细胞周期及凋亡，实验组G0/G1期细胞比例从48.6％增加至63％，数据有统计学意义(P＜0.05);凋亡率实验组高于空白对照组，差异未达到统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:我们成功构建并表达了RP215-VH抗体，且该抗体能与乳腺癌细胞表面抗原CA215特异性相结合，表明其具有抗原抗体免疫活性。通过功能实验，我们发现RP215-H能使乳腺癌MB231细胞周期停滞在G0-G1期。由于RP215-VH能准确定位肿瘤细胞表面CA215抗原，该抗体可能可以应用于肿瘤的诊断及靶向治疗中。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一章 pET32a(+)-RP215-VH重组质粒的构建

1 材料

2 方法

3 结果

第二章 pET32a(+)-RP215-VH重组质粒表达和纯化

1 材料

2 方法

3 结果

第三章 RP215-VH活性研究

1 材料

2 方法

3 结果

讨论

全文总结

参考文献

文献综述 肿瘤细胞表达的免疫球蛋白和CA215

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文